الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Summary

يمكن استخدامها في الدراسات الوراثية الخميرة للتحقيق في وظائف الجزيئية والخلوية من الجينات البشرية في استقلاب الحمض النووي الخلوي. ووصف طرق للتوصيف الوراثية للإنسان

Abstract

فهم دور كل من البروتينات البشرية إصلاح الحمض النووي الوراثي في ​​مسارات تشكل تحديا هائلا لكثير من الباحثين. واقتصرت الدراسات الوراثية في نظم الثدييات بسبب عدم وجود الوسائل المتاحة بما في ذلك تعريف بسهولة متحولة خطوط الخلايا الوراثية ، والنظم التنظيمية التعبير ، وعلامات اختيار المناسب. للتحايل على هذه الصعوبات ، أصبحت أنظمة النموذج الجيني في حقيقيات النواة أقل خيارا جذابا لدراسة الحفظ وظيفيا البروتينات إصلاح الحمض النووي والممرات. قمنا بتطوير نظام الخميرة نموذج لدراسة وظائف محددة بشكل واضح الجينية لمتلازمة ويرنر helicase - nuclease (

Protocol

1. سلالات الخميرة

سلالات مع TOP3 SGS1 البرية من نوع (WT ؛ W303 - 1A ، الوراثي ، MAT a ade2 - 1 canl - 100 his3 - 11 ، 15 leu2 - 3 ، 112 trpl - L ura3 - 1) [2] ، وهو sgs1 متحولة (W1292 - 3C ؛ MAT الوراثي a SUP4 س : URA3 sgs1 - 25 ade2 - 1 can1 - 100 his3 - 11 ، 15 leu2 - 3 ، 112 trp1 - 1 ura3 - 1 rad5 - 535) وsgs1 top3 متحولة (W1058 - 11C ، الوراثي ، MAT a SUP4 س : URA3 sgs1 - 25 top3 - 2 : : HIS3 ade2 - 1 can1 - 100 his3 - 11 ، 15 leu2 - 3 ، 112 trp1 - 1 ura3 - 1 اتسمت rad5 - 535) [3] وقدمت تفضلت بواسطة الدكتور رودني Rothstein (جامعة كولومبيا).

2. الانشاءات DNA البلازميد

تم استنساخ الجين WRN في YEp112SpGAL التالية المخطط كما تمت مناقشته.

1. موقع الموجه من الطفرات WRN (E84A نوكلياز خارجية الموتى ، K577M helicase الموتى ، R834C وK1016A) في WRN - YEp195SpGAL البلازميد [4] تم بناؤها باستخدام بادئات مطفرة وبروتوكول قياسي من XL Quickchange الثاني طقم موقع الطفرات الموجهة (Stratagene) Lofstrand بواسطة مختبرات (غايثرسبيرغ ، دكتوراه في الطب).
2. وتنقيته هلام شظايا الحمض النووي الترميز WRN والمتغيرات المرتبطة بها من بنيات YEp195SpGAL - WRN منها بعد الهضم مزدوجة مع أنني أولا وسال Mlu
3. والمستنسخة ثم هلام شظايا في تنقية مواقع سال أنا أنا Mlu من YEp112SpGAL النواقل ، (أ) 2 ميكرومتر نسخ متعددة البلازميد التي تحتوي على علامة TRP1 اختياره لبناء WRN YEp112SpGAL أو المتغيرات WRN تحت سيطرة أحد المروجين غال محرض ، كما هو مبين في الشكل (1) .
4. كان اسمه حتى يبني الحصول YEp112SpGAL - WRN ، E84A YEp112SpGAL - WRN ، K577M YEp112SpGAL - WRN ، K1016A YEp112SpGAL - WRN ، وR834C YEp112SpGAL - WRN.

3. تحول

كانت تزرع ثقافات الخميرة باستخدام بروتوكول قياسي والتحولات أجريت باستخدام خلات المستندة إلى بروتوكول ليثيوم بواسطة Gietz آخرون [5]. لفترة وجيزة ، تم تنفيذ الخطوات التالية.

1. كانت تزرع ثقافات السلالات المذكورة أعلاه بين عشية وضحاها في YPD 5 مل (خلاصة الخميرة ، ببتون - دكستروز) المتوسط. وreinoculated الثقافات في المتوسط ​​50 مل YPD وسمح لتنمو حتى يصل OD ₆₀₀ من 1.0 -- تم التوصل الى 1.2.
2. وكان حصاد الثقافات ، وغسلها بالماء 20 مل ، ومعلق في 1 مل من 100 ملي خلات ليثيوم (LiAc). وحضنت الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
3. وكان بيليه معلق الخلية في LiAc 100 ملم على الحجم النهائي من 500 ميكرولتر ، وهو ما يكفي لالقيام بعشرة التحولات. وكان aliquoted 50 ميكرولتر لتعليق خلية خلية ، وكان بيليه جمعها بواسطة الطرد المركزي.
4. إلى الخلية وأضاف بيليه في الترتيب التالي : 250 البولي ايثيلين جلايكول ميكرولتر 50 ٪ (PEG) ، و 36 ميكرولتر من LiAc M 1 ، 25 ميكرولتر من ssDNA ملغ / مل 2 (السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية) ، و 5 مل من الحمض النووي البلازميد (100 نانوغرام 1000 نانوغرام) ، و 50 ميكرو لتر ماء. وكان بيليه لvortexed الخلية 1 دقيقة.
5. وحضنت ثم الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
6. وكان حصاد الخلايا ومعلق في مل من الماء 1. منذ YEp112SpGAL البلازميد يحتوي على الحزب باعتباره علامة اختيار ، فإن جميع سلالات متحولة إيواء بناء الحزب أن يتقن. ولذلك ، تم اختيار transformants بواسطة الطلاء تعليق على SC (الاصطناعية كاملة) الجلوكوز وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان واحتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام حتى تظهر المستعمرات.

4. تحولت التحليل الجيني لاستعادة النمو البطيء في النمط الظاهري WRN sgs1 top3 السلالة.

1. تحليل الشريط :

1. لدراسة تأثير التعبير WRN على نمو البرية من نوع الوالدين (W303 - 1A) ، sgs1 ، أو sgs1 سلالات top3 ، والمقابلة مع سلالات YEp112SpGAL أو YEp112SpGAL WRN كان يشوبه - SC ناقص على لوحات تحتوي على التربتوفان إما الجلوكوز (2 ٪ حمض الغلوتاميك) أو 2 ٪ الجالاكتوز (غال). كعنصر تحكم ، أدرج sgs1 top3 / YEp112SpGAL SGS1. والمحتضنة لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
2. لتحديد قدرة WRN تؤثر على معدل النمو من سلالة top3 sgs1 عند مستويات أقل WRN بروتين تعبير ، وتحول سلالة sgs1 top3 مع YEp112SpGAL ، YEp112SpGAL - WRN ، أو كان يشوبه YEp112SpGAL - SC SGS1 على التربتوفان ناقص لوحات تحتوي على تركيزات مختلفة من غال من منخفضة تصل إلى 0.005 ٪ ليصل الى 2 ٪. والمحتضنة لوحات ثم في 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
3. لتقييم الاحتياجات الوظيفية للWRN النمط الظاهري لاستعادة النمو البطيء في الخلفية top3 sgs1 ، sgs1 top3 تحولت مع YEp112SpGAL - WRN (E84A ، K577M ، R834C وK1016A) كانت streaked على لوحات تحتوي على التربتوفان SC ناقص إما حمض الغلوتاميك أو غال على تركيزات المشار إليها. للضوابط ، أدرج sgs1 top3 سلالة تحولت مع YEp112SpGAL ، YEp112SpGAL WRN أو YEp112Sp GAL - SGS1. والمحتضنة لوحات ثم في 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.

2. السائل ثقافة التحليل :

1. لتقييم نمو سلالات sgs1 top3 تحول في الثقافة السائل ، وكانت تزرع في خلايا الخميرة RAF SC التربتوفان ناقص 30 درجة مئوية في الليل. وreinoculated الثقافات في سلاح الجو الملكي البريطاني SC ناقص التربتوفان ونمت عند 30 درجة مئوية للتخلص سجل في وقت مبكر (OD ₆₀₀ من ~ 0.5). ثم كانت reinoculated OD _0.05 في الثقافات في وسائل الإعلام التي تحتوي SC غال 2 ٪ والنمو وأعقب ذلك عن طريق قياس الامتصاصية في الفواصل الزمنية المشار إليها.

5. تحولت التحليل الجيني للهيدروكسي يوريا أو methylmethane - سلفونات الحساسية في WRN سلالات الخميرة.

1. لتحديد تأثير التعبير WRN على حساسية MMS وHU من sgs1 sgs1 top3 أو سلالات ، سلالات تحولت مع YEp112SpGAL أو YEp112SpGAL WRN ، كانت تزرع في سلاح الجو الملكي البريطاني في التربتوفان SC ناقص 30 درجة مئوية.
2. وreinoculated الثقافات في سلاح الجو الملكي البريطاني SC ناقص التربتوفان ونمت عند 30 درجة مئوية للتخلص سجل في وقت مبكر (OD ₆₀₀ من ~ 0،6-0،8).
3. وقد أعدت عشرة أضعاف التخفيفات المتسلسلة لهذه السلالات به SC المتوسطة تفتقر التربتوفان. من ثقافة المتنامية باطراد ، اتخذت 5 × 10 ⁶ خلايا والمخففة متسلسل يصل إلى أضعاف 10،000. شوهد أربعة microliters كل غال على تخفيف لوحات SC التربتوفان ناقص يحتوي على تركيزات أشار هو جين تاو أو MMS. والمحتضنة لوحات في 30 درجة مئوية.
4. كعنصر تحكم والبرية من نوع السلالة الأبوية (W303 - 1A) تحولت مع WRN - YEp112SpGAL YEp112SpGAL أو ، أو sgs1 top3 / YEp112SpGAL SGS1 - عولج على النحو المبين أعلاه.

6. تتحول الخلية توزيع دورة WRN sgs1 top3 السلالة.

1. لدراسة توزيع دورة الخلية تتحول من WRN sgs1 top3 السلالة ، ثقافات sgs1 top3 تحولت مع YEp112SpGAL ، YEp112SpGAL WRN ، أو YEp112SpGAL SGS1 ، وتحويل ناقلات برية من نوع السلالة الأبوية (W303 - 1A) كانت تزرع في سلاح الجو الملكي البريطاني SC الحزب ناقص 30 درجة مئوية في ليلة وضحاها.
2. وreinoculated الثقافات في OD _0.05 ويسمح لتنمو سمسم مرحلة مبكرة سجل (OD ₆₀₀ من 0.5 -0.6) ، وكان المستحث WRN التعبير عن طريق إضافة إلى التركيز النهائي غال 2 ٪. ثم سمح للثقافات أن ينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة ساعة 6
3. ثم تم تجهيزها للثقافات دابي (4 ، 6 - 2 - diamidino phenylindole) تلطيخ.
   1. وكان حصاد الثقافات عن طريق الطرد المركزي في XG 5800 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. وجرفت المياه مرة واحدة مع الخلايا 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، وكانت ثابتة في الإيثانول ثم 70 ٪ لمدة 20 دقيقة في RT.
   3. تم غسلها مرتين مع الخلايا الثابتة PBS X 1 ، وأخيرا في برنامج تلفزيوني معلق 1X.
4. وضعت الخلايا على الشريحة والتي تقام في تصاعد Vectashield المتوسطة مع دابي (1 ميكروغرام / مل) (ناقل ، الولايات المتحدة). تم فحص الخلايا مع مجهرا Axiovert M 200 (زايس ؛ عدسة 100X) ومركب على النقيض تدخل الفرق (DIC). وقد تم تحليل الصور باستخدام AxioVision مضان ، الإصدار 3.0 برنامج (زايس).

7. تحليلات غربية لطخة.

1. لتحديد بروتين تعبير عن المتغيرات أو WRN WRN في sgs1 حولت أو sgs1 top3 سلالات ، أعدت lysates بواسطة الطريقة التالية والبروتينات التي حللها immunblotting.

1. وقد نمت تحول sgs1 أو sgs1 top3 سلالات في سلاح الجو الملكي البريطاني في التربتوفان SC ناقص 30 درجة مئوية ليلة وضحاها.
2. وreinoculated الثقافات والمحتضنة في 30 درجة مئوية حتى مرحلة مبكرة سجل (OD ₆₀₀ من 0،5-0،8) ، ثم اضاف الناجم عن غال إلى التركيز النهائي 2 ٪. ثم سمح للثقافات أن ينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة ساعة 6
3. وقد تم جمع الخلايا (3 مل) بواسطة الطرد المركزي وغسلها مع برنامج تلفزيوني. وكان بيليه معلق الخلية في المخزن تحلل القلوية [50 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 10.5 و 2 مم EDTA ، 1 فلوريد phenylmethylsulfonyl ملم (PMSF) ، و 2 ٪ SDS ، الجلسرين 10 ٪ ، 5 ٪ 2 - المركابتويثانول ومثبطات الأنزيم البروتيني (الكيميائية الحيوية الجزيئية روش)] مغلي لمدة 5 دقائق ، والموضحة بواسطة الطرد المركزي ، ومتعادلة مع حمض الهيدروكلوريك M 1.
4. تم حل كميات من البروتينات يعادل lysate خلية في 8-16 ٪ بولي أكريلاميد SDS المواد الهلامية.

2. لتحديد مستوى من التعبير عن بروتين WRN تحت تأثير تركيزات مختلفة من اللبن ، تم تجهيز الثقافات على النحو التالي.

1. وقد نمت تحول sgs1 top3 سلالات في سلاح الجو الملكي البريطاني SC التربتوفان ناقص درجة مئوية في 30 ليلة وضحاها.
2. وreinoculated الثقافات والمحتضنة في 30 درجة مئوية حتى مرحلة مبكرة سجل (OD ₆₀₀ من 0،5-0،8) والتي يسببها ثم بإضافة الجال لتركيز النهائي 2 ٪. ثم سمح للثقافات أن ينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة ساعة 6
3. وكان حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومعلق في المخزن (50 ملي تريس - CL ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 1 ٪ deoxycholate الصوديوم ، 1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل [SDS]) مثبطات الأنزيم البروتيني تحتوي على (0.05 ٪ PMSF ، 0.05 ميكروغرام / مل leupeptin).
4. تم إضافة الخرز الزجاجي (425-600 ميكرون) إلى الخليط ، وتحطمت الخلايا vortexing.
5. وكان لطرد جناسة الناتجة عن 5 دقائق على 15000 XG وجمعت الكسر طاف.
6. ويقدر البروتين في الكسور lysate حسب الطريقة برادفورد.
7. تم حل تركيز متساو من البروتين من كسور مختلفة في lysate 8-16 ٪ بولي أكريلاميد SDS المواد الهلامية.

3. تم تحديد التعبير عن البروتينات متحولة أو WRN WRN بواسطة لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس WRN الموجهة ضد حاتمة في جزء C - محطة تنقية للWRN [6] (1:1000 ، وادي الربيع مختبرات).

4. وتبع الابتدائية حضانة الضد من قبل الحضانة مع الأضداد (الفجل البيروكسيداز - مترافق) الثانوي (1:5000). تم معالجة البقع مع نظام كشف ECL بلس الغربية في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

5. لطخة غربية التحليل الكمي ، وزيادة تركيزات المنقى المؤتلف أدرجت صاحب الموسومة بروتين WRN على كامل طول هذه المواد الهلامية التي على القياس الكمي لطخة يمكن توليد منحنى القياسية الخطية. كذلك ، تم تحميل استخراج خلية من خلايا مبلغ يعادل 20 ميكروغرام أو من العينات lysate الخميرة على المواد الهلامية لتقدير تركيز WRN.

6. ثم تم إجراء تحليل ImageQuant على المواد الهلامية ومنحنى خطي قياسية قد ولدت.

7. ويقدر تركيز بروتين WRN بتركيزات متفاوتة غال باستخدام معيار إنشاء منحنى خطي أعلاه.

8. ممثل النتائج

جميع السلالات المستخدمة في هذه الدراسة هي auxotrophs التربتوفان. وقد اختيرت لذلك ، sgs1 ، sgs1 top3 واكتب البرية W303 - 1A سلالات تحولت مع YEp112SpGAL أو YEp112SpGAL WRN ، على أساس قدرتها على النمو في وجود وسائل الإعلام SC ناقص التربتوفان. لدراسة تأثير التعبير WRN على نمو الخلايا تحولت top3 sgs1 متحولة ، ويشوبه الثقافات على لوحات تحتوي على التربتوفان SC ناقص وسائل الاعلام مع غال 2 ٪ للحث على التعبير WRN. Top3 decatenates متشابكة جزيئات الحمض النووي التي تم إنشاؤها بواسطة Sgs1 helicase خلال تكرار [1 ، 2] ، وبالتالي ، في غياب Top3 ، لا يعفى الإجهاد الالتواء مما أدى بطء النمو المفرط وإعادة التركيب. وظيفة الجيني للsgs1 هو النمط الظاهري لقمع النمو البطيء لtop3 متحولة. إذا يمكن أن تحل محل WRN SGS1 في التفاعل مع Top3 الوراثية ، يتوقع استعادة top3 النمط الظاهري النمو البطيء في sgs1 top3.

حولت WRN كما هو مبين في الشكل 2A ، sgs1 top3 سلالة نمت بشكل ملحوظ أكثر ببطء مقارنة مع ناقلات تحولت sgs1 top3 السلالة. sgs1 top3 تحولت مع تضمين YEp112SpGAL - SGS1 كان البلازميد كعنصر تحكم إيجابية (الشكل 2A) ، مما يدل على أن من النوع البري وأعرب في Sgs1 متحولة top3 sgs1 قادرة على تكملة وراثيا النمط الظاهري النمو. نما تحولت sgs1 top3 سلالات بالمثل في غياب غال كما هو موضح لمدة 2 يوم (الشكل 2A). وكان التعبير عن WRN أي تأثير على نمو سلالات برية الوالدين من نوع (W3031A) أو sgs1 (الشكل 2B) ، مشيرا الى ان تأثير على نمو الخلايا WRN كانت محددة لتلك التي لوحظت في الخلفية top3 sgs1 متحولة. إجراء دراسات وراثية باستخدام المتغيرات WRN أظهرت أن هناك حاجة WRN helicase لكن ليس النشاط نوكلياز خارجية من أجل استعادة النمو top3 النمط الظاهري (الشكل 3B). ألغى تعدد الأشكال التي تحدث بشكل طبيعي في مغلطة WRN الذي يتداخل مع النشاط helicase قدرته على استعادة النمط الظاهري top3 النمو البطيء.

يتم تأخير top3 سلالات متحولة في مرحلة متأخرة من S/G2 دورة الخلية [1] ، وهي السمة التي قد تكون مسؤولة عن نموها بطيء. تحور الجين SGS1 في الخلفية top3 يقمع التأخير في المرحلة S/G2 من دورة الخلية. إذا WRN التعبير يمكن أن تعيد للتأخير في المرحلة S/G2 من دورة الخلية في sgs1 top3 ، يتوقع ارتفاع عدد السكان من الخلايا budded كبيرة مع الأنوية غير مقسمة لخلايا متحولة top3 sgs1 معربا عن WRN. كما هو مبين في الشكل 4 ، وكانت نسبة كبيرة من الخلايا budded أعلى للsgs1 WRN / top3 من sgs1 top3 / ناقل ، مما يشير إلى استعادة دي S/G2 تكمن سمات top3.

وsgs1 top3 مزدوجة متحولة هو أقل حساسية للMMS أو HU من متحولة top3 واحد [2]. منذ نمو الخلايا المتضررة من WRN sgs1 top3 ، درسنا القادم تأثيرها على الحساسية لسلفونات methylmethane (MMS ، وكيل مؤلكل) وهيدروكسي يوريا (HU ، مثبط النسخ المتماثل). sgs1 top3 / WRN عرض حساسية للأدوية على حد سواء مقارنة sgs1 top3 / SGS1 (الشكل 5). وكشف التحليل الجيني للمتغيرات WRN أن هناك حاجة WRN helicase / أتباز ، ولكن ليس WRN النشاط نوكلياز خارجية ، لتأثيرها على الحساسية لرسائل الوسائط المتعددة وHU.

الشكل 1. عرض تخطيطي للمتغيرات WRN / WRN الاستنساخ في ناقلات YEp112SpGAL الرجاء انقر هنا لنسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2. WRN التعبير في top3 sgs1 النمط الظاهري يستعيد النمو البطيء للtop3. كانت لوحة يشوبه ألف ، sgs1 top3 سلالة تحولت مع YEp112SpGAL أو WRN YEp112SpGAL على صفيحة تحتوي على التربتوفان SC - 2 ٪ حمض الغلوتاميك إما غال أو 2 ٪. كما كان يشوبه عنصر تحكم sgs1 top3 سلالة تحولت مع SGS1 YEp112SpGAL على لوحات على حد سواء. والمحتضنة لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام وصورت ذلك الحين. وحة B ، نوع السلالة البرية الوالدية W303 - 1A أو سلالة sgs1 تحولت مع YEp112SpGAL أو WRN YEp112SpGAL كان يشوبه على صفيحة SC - التربتوفان التي تحتوي على حمض الغلوتاميك إما 2 ٪ أو غال 2 ٪ . والمحتضنة لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 4 أيام وصورت ذلك الحين. تم تكوين لوحات في لوحة وألف وباء الفريق على التوالي. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

الشكل 3. مطلوب WRN أتباز / helicase ، ولكن ليس النشاط نوكلياز خارجية ، لاستعادة النمط الظاهري النمو البطيء للtop3 في الخلفية top3 sgs1. sgs1 top3 تحول مع سلالة ميتة helicase أتباز / (YEp195SpGAL K577M WRN) ، نوكلياز خارجية ميتا (YEp195SpGAL - WRN E84A) ، وكان يشوبه RQC متحولة (YEp195SpGAL - K1016A WRN) ، أو متعدد الأشكال الطافرة (YEp195SpGAL - WRN R834C) على SC - التربتوفان لوحات تحتوي على حمض الغلوتاميك إما 2 ٪ (لوحة C) أو 2 ٪ غال (لوحة باء). والمحتضنة لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام وصورت ذلك الحين. تكوين لوحات كما في ألف لوحة من فضلك انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 3.

الشكل 4. WRN التعبير يحرض S/G2 الاعتقال في زنازين top3 sgs1. Logarithmically الثقافات المتزايد من سلالة top3 sgs1 تحولت مع YEp112SpGAL ، WRN YEp112SpGAL ، أو YEp112SpGAL SGS1 ، وكان المستحث على ناقلات تحولت البرية من نوع السلالة الأبوية في تركيز غال 2 ٪ لمدة 6 ساعة وكان حصاد الثقافات ، وتجهيزها لتلطيخ دابي كما هو موضح في مواد وأساليب وشوهدت باستخدام المجهر Axiovert M 200 (زايس ؛ عدسة 100X). أظهرت هو تلطيخ دابي من top3 sgs1 تحولت مع YEp112SpGAL (العلوي الأيسر) ومع YEp112SpGAL WRN (أعلى اليمين). الأسهم تظهر الخلايا مع نوى غير مقسمة. ويظهر توزيع الخلايا في G1 (خلايا واحد) وS/G2 (خلايا budded) في اللوحة السفلى. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 4.

الشكل 5. أثر التعبير WRN على حساسية MMS وHU من سلالة top3 sgs1. المتزايد Logarithmically ثقافات سلالة top3 sgs1 تحولت مع YEp112SpGAL ، YEp112SpGAL WRN ، نوكلياز خارجية ميتا (YEp112SpGAL - E84A WRN) ، أتباز / helicase - قتيلا ، و (WRN YEp112SpGAL K577M) RQC متحولة (YEp112SpGAL - K1016A WRN) ، متعددة الأشكال الطافرة (YEp112SpGAL - R834C WRN) ، حولت YEp112SpGAL SGS1 وناقلات نوع البرية شوهدت السلالات الأبوية في التخفيفات عشرة أضعاف على المسلسل SC - التربتوفان لوحات تحتوي على حمض الغلوتاميك أو غال ، وإما MMS أو HU في تركيزات المشار إليها. والمحتضنة لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 2 يوم (لوحات التحكم) و 4 أيام (MMS وألواح HU) ومن ثم تصويرها. من فضلك9/1639fig5.jpg "> انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 5.

Discussion

واحدة من نقاط القوة لاستخدام خميرة كنظام النموذج هو توافر المسوخ في تكرار الحمض النووي وتحديد المسارات التي يتم حفظها إصلاح بين الخميرة والبشر. اختيار المزيد من transformants إيواء جينات معينة سهلة وموثوقة مثل سلالات المختبرية المسوخ عونية التغذي وناقلات مع علامات عونية التغذي متوفرة بسهولة. ويمكن استخدام هذه النواقل ينظم التعبير الجيني للمنتجات عن طريق وضعها تحت السيطرة على المروج محرض (على سبيل المثال ، غال المروج محرض ، الخ). وبالنظر إلى هذه المزايا ، قمنا بتطوير نظام الخميرة نموذج يستند إلى دراسة الاحتياجات الوظيفية من الجينات المعيبة WRN الإنسان في متلازمة ويرنر في المسار الذي يتم حفظها المحتمل بين الإنسان والخميرة. باستخدام أساليب وصفها ، قدمنا ​​أول دليل على أن WRN يمكن أن تعمل في مسار الوراثية التي تؤثر على top3 الظواهر ذات الصلة. ملاحظاتنا موجه مزيد من التحقيقات في احتمال أن تتفاعل وظيفيا مع WRN Top3α في الخلايا البشرية خلال تكرار الحمض النووي الخلوي أو إعادة التركيب. تصور ، في حالة ضعف ، بلم ، قد WRN بديلا جزئيا عن طريق الشراكة بلم البروتين مع topoisomerase.