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Biology

मानव डीएनए की मरम्मत प्रोटीन के आनुवंशिक अध्ययन एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर का उपयोग

Published: March 18, 2010 doi: 10.3791/1639
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, NIH

Summary

खमीर में आनुवंशिक अध्ययन सेलुलर डीएनए के चयापचय में मानव जीन की आणविक और सेलुलर कार्यों की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. तरीके मानव के आनुवंशिक लक्षण वर्णन के लिए में वर्णित हैं

Abstract

आनुवंशिक रास्ते में मानव डीएनए की मरम्मत प्रोटीन की भूमिका को समझना कई शोधकर्ताओं के लिए एक दुर्जेय चुनौती है. स्तनधारी प्रणाली में आनुवंशिक अध्ययन उत्परिवर्ती आनुवंशिक सेल परिभाषित लाइनों, विनियामक अभिव्यक्ति प्रणाली, और उचित चयन मार्करों सहित आसानी से उपलब्ध उपकरणों की कमी के कारण सीमित किया गया है. इन कठिनाइयों को दरकिनार करने के लिए, कम eukaryotes में मॉडल आनुवंशिक सिस्टम कार्यात्मक संरक्षित डीएनए की मरम्मत प्रोटीन और रास्ते के अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प बन गए हैं. हम एक मॉडल खमीर वर्नर सिंड्रोम helicase - nuclease के खराब परिभाषित आनुवंशिक कार्यों का अध्ययन प्रणाली विकसित की है (

Protocol

1. खमीर उपभेदों

जंगली प्रकार SGS1 TOP3 के साथ खींच (WT, W303-1A, जीनोटाइप, मेट ade2 एक canl-100 his3 11 - 15 leu2-3, 112 trpl - एल ura3-1) [2], एक sgs1 उत्परिवर्ती (W1292- 3C ; जीनोटाइप मेट एक SUP4 - ओ:: URA3 sgs1-25 can1-100 his3 11-ade2-1, 15 leu2 3-, 112 trp1 - एक rad5 535 - ura3-1) और एक sgs1 TOP3 उत्परिवर्ती (W1058-11C, जीनोटाइप, मेट एक SUP4 ओ:: URA3 sgs1-25 TOP3-2:: HIS3 ade2 - एक can1-100 his3 11 -, 15 leu2 3-, 112 trp1 - एक ura3 एक rad5 535 -) [3] किया गया विशेषता है और कृपया प्रदान थे डॉ. रॉडने रोथस्टीन (कोलंबिया विश्वविद्यालय) के द्वारा.

2. प्लास्मिड डीएनए निर्माण

WRN जीन YEp112SpGAL में के रूप में चर्चा की योजना निम्नलिखित क्लोन किया गया था.

  1. WRN की साइट निर्देशित प्लाज्मिड YEp195SpGAL WRN में म्यूटेशन (E84A exonuclease मृत, K577M helicase मृत, R834C, और K1016A) [4] Quickchange द्वितीय एक्स्ट्रा लार्ज साइट निर्देशित mutagenesis के किट (Stratagene) से mutagenic प्राइमरों और एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए निर्माण Lofstrand प्रयोगशालाओं (Gaithersburg, एमडी) द्वारा.
  2. डीएनए टुकड़े एन्कोडिंग WRN और उसके जुड़े वेरिएंट जेल साल मैं और MLU मैं के साथ डबल पाचन के बाद संबंधित YEp195SpGAL WRN constructs से शुद्ध थे
  3. जेल शुद्ध टुकड़े तो साल वेक्टर YEp112SpGAL, सुक्ष्ममापी 2 प्लाज्मिड बहु प्रति एक TRP1 चयन मार्कर युक्त YEp112SpGAL WRN या WRN वेरिएंट एक लड़की के inducible प्रमोटर के नियंत्रण के तहत निर्माण के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है की मैं MLU मैं साइटों में क्लोन किया गया .
  4. constructs इतना प्राप्त YEp112SpGAL - WRN, YEp112SpGAL WRN-E84A, YEp112SpGAL WRN K577M, YEp112SpGAL WRN-K1016A, और YEp112SpGAL WRN R834C के रूप में नामित किया गया.

3. परिवर्तन

खमीर संस्कृतियों मानक प्रोटोकॉल और परिवर्तनों थे प्रदर्शन का उपयोग कर एक लिथियम Gietz एट अल द्वारा एसीटेट आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग बड़े हो रहे थे. [5] संक्षेप में, निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन किया गया.

  1. उपरोक्त उपभेदों की संस्कृतियों रातोंरात 5 मिलीलीटर YPD (खमीर निकालने peptone - dextrose) मध्यम में बड़े हो रहे थे. 50 मिलीलीटर YPD मध्यम में reinoculated संस्कृतियों थे और थे 1.0 के एक आयुध डिपो 600 जब तक बढ़ने की अनुमति दी - 1.2 तक पहुँच गया था.
  2. संस्कृतियों काटा 20 मिलीलीटर पानी के साथ धोया, और 100 मिमी लिथियम एसीटेट (LiAc) के 1 मिलीलीटर में resuspended. कक्ष में 30 ° 10 मिनट के लिए सी incubated रहे थे.
  3. सेल गोली 100 मिमी LiAc में 500 μl, जो दस परिवर्तनों करने के लिए पर्याप्त है की अंतिम मात्रा को resuspended था. सेल निलंबन का 50 μl aliquoted था और सेल गोली centrifugation द्वारा एकत्र की गई थी.
  4. 250 50% μl Polyethylene (खूंटी) glycol, 1 एम LiAc, 2 मिलीग्राम / एमएल (सामन शुक्राणु डीएनए) ssDNA, प्लास्मिड डीएनए के 5 मिलीलीटर (100 एनजी के 25 μl 36 μl: सेल के लिए गोली निम्नलिखित क्रम में जोड़ा गया 1000) एनजी, और 50 μl पानी. सेल गोली 1 मिनट के लिए vortexed था.
  5. कक्ष फिर 30 में incubated रहे थे डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए 42 पर एक गर्मी झटका द्वारा पीछा किया.
  6. कक्ष और काटा गया 1 मिली लीटर पानी में resuspended. प्लाज्मिड YEp112SpGAL के बाद से एक चयन मार्कर के रूप में trp शामिल हैं, सभी उत्परिवर्ती का निर्माण शरण उपभेदों trp कुशल होगा. इसलिए, transformants अनुसूचित जाति (पूरा सिंथेटिक) ग्लूकोज मीडिया टीआरपी की कमी और 30 में incubating प्लेटों पर निलंबन चढ़ाना द्वारा चयन किया गया था ° सी 3-4 दिनों के लिए जब तक कालोनियों दिखाई देते हैं.

4. WRN में धीमी गति से विकास phenotype बहाली के जेनेटिक विश्लेषण sgs1 TOP3 तनाव बदल दिया.

1. स्ट्रीक विश्लेषण:

  1. जंगली प्रकार माता - पिता विकास (W303 -1 ए), sgs1, या sgs1 TOP3 उपभेदों YEp112SpGAL या YEp112SpGAL - WRN इसी के साथ उपभेदों थे अनुसूचित जाति शून्य टीआरपी या तो 2% ग्लूकोज युक्त प्लेटों पर रेखादार पर WRN अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच ( glu) या 2% galactose (लड़की). किसी नियंत्रण के रूप में, sgs1 TOP3 / YEp112SpGAL - SGS1 शामिल किया गया था. प्लेट्स 30 ° C पर 2 दिनों के लिए incubated रहे थे.
  2. WRN की क्षमता कम WRN प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर sgs1 TOP3 तनाव की विकास दर को प्रभावित निर्धारित sgs1 TOP3 तनाव YEp112SpGAL, YEp112SpGAL - WRN के साथ बदल, या YEp112SpGAL SGS1 अनुसूचित जाति शून्य टीआरपी प्लेटों पर रेखादार से लड़की के अलग सांद्रता युक्त के रूप में कम के रूप में 0.005% 2% के रूप में उच्च के रूप में. प्लेट्स तो 2 दिनों के लिए 30 ° C पर incubated.
  3. WRN के कार्यात्मक आवश्यकताओं का आकलन sgs1 TOP3 पृष्ठभूमि में धीमी गति से विकास phenotype बहाल करने के लिए, TOP3 sgs1 YEp112SpGAL WRN (E84A, K577M, R834C, और K1016A) के साथ बदल stre थेअनुसूचित जाति शून्य टीआरपी संकेत सांद्रता में या तो glu या लड़की युक्त प्लेटों पर aked. नियंत्रणों के लिए, को sgs1 TOP3 YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN या लड़की SGS1 YEp112Sp के साथ तब्दील तनाव शामिल किया गया था. प्लेट्स तो 2 दिनों के लिए 30 ° C पर incubated.

2. लिक्विड संस्कृति विश्लेषण:

  1. बदल तरल संस्कृति में sgs1 TOP3 उपभेदों के विकास का मूल्यांकन करने के लिए, खमीर कोशिकाओं अनुसूचित जाति आरएएफ शून्य टीआरपी में 30 ° रात भर सी में बड़े हो रहे थे. संस्कृतियों अनुसूचित जाति आरएएफ शून्य टीआरपी में reinoculated थे और 30 में डिग्री सेल्सियस जल्दी लॉग चरण (0.5 ~ 600 आयुध डिपो) हो गई. संस्कृतियों को तो अनुसूचित जाति के 2% की लड़की और विकास युक्त मीडिया में 0.05 आयुध डिपो में reinoculated थे संकेत समय अंतराल पर absorbance को मापने के द्वारा पीछा किया गया था.

5. Hydroxyurea या WRN में methylmethane sulfonate संवेदनशीलता जेनेटिक विश्लेषण खमीर उपभेदों बदल दिया.

  1. Sgs1 या sgs1 TOP3 उपभेदों, उपभेदों YEp112SpGAL या YEp112SpGAL - WRN के साथ बदल के एमएमएस और एच यू संवेदनशीलता पर WRN अभिव्यक्ति के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अनुसूचित जाति आरएएफ शून्य टीआरपी में 30 में बड़े हो रहे थे डिग्री सेल्सियस
  2. संस्कृतियों अनुसूचित जाति आरएएफ शून्य टीआरपी में reinoculated थे और 30 में डिग्री सेल्सियस जल्दी लॉग चरण (~ को 0.6 0.8 के आयुध डिपो 600) हो गई.
  3. इन उपभेदों के दस गुना धारावाहिक dilutions अनुसूचित जाति टीआरपी कमी माध्यम का उपयोग कर तैयार थे. एक तेजी से बढ़ रही संस्कृति से 5 x 10 6 कोशिकाओं उठाए थे और serially पतला 10,000 गुना. प्रत्येक कमजोर पड़ने के चार microliters अनुसूचित जाति लड़की ऋण टीआरपी HU या एमएमएस के संकेत सांद्रता युक्त प्लेटों पर देखा गया था. प्लेट्स 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे
  4. किसी नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार माता - पिता तनाव (W303-1 ए) YEp112SpGAL या YEp112SpGAL WRN, या sgs1 TOP3 / YEp112SpGAL SGS1 के साथ बदल गया था इलाज के रूप में ऊपर वर्णित है.

6. सेल WRN के चक्र वितरण sgs1 TOP3 तनाव बदल दिया.

  1. WRN की कोशिका चक्र वितरण का अध्ययन करने के लिए sgs1 तनाव TOP3, YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, या YEp112SpGAL SGS1 के साथ बदल TOP3 sgs1 की संस्कृतियों, और सदिश तब्दील जंगली प्रकार माता - पिता तनाव (W303-1 ए) बदल अनुसूचित जाति आरएएफ में बड़े हो रहे थे 30 में शून्य trp ° रात भर के लिए सी.
  2. संस्कृतियों 0.05 आयुध डिपो में reinoculated थे और जल्दी लॉग चरण (-0.6 0.5 के आयुध डिपो 600) तिल बढ़ने की अनुमति दी WRN अभिव्यक्ति. 2% की अंतिम एकाग्रता के लिए लड़की को जोड़ने के द्वारा प्रेरित किया गया था. संस्कृतियों को तो 30 से बढ़ने की अनुमति दी गई ° 6 एच. के लिए सी
  3. संस्कृतियों तो DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया.
    1. संस्कृतियों 5800 XG पर कमरे के तापमान (आर टी) पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा काटा गया.
    2. कोशिकाओं को एक बार से धोया गया फॉस्फेट 1X buffered खारा (पीबीएस) थे और तब आरटी पर 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में तय है.
    3. फिक्स्ड कोशिकाओं 1 एक्स पीबीएस के साथ दो बार धोया गया, और अंत में 1X पीबीएस में resuspended.
  4. कक्ष स्लाइड पर रखा गया और Vectashield में घुड़सवार DAPI (1 μg / एमएल) (वेक्टर, संयुक्त राज्य अमरीका) के साथ मध्यम बढ़ते. और समग्र अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी); कक्ष Axiovert 200 एम सूक्ष्मदर्शी (100x Zeiss लेंस) के साथ जांच की गई. प्रतिदीप्ति छवियों AxioVision, संस्करण 3.0 कार्यक्रम (Zeiss) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया.

7. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण.

1. WRN प्रोटीन की अभिव्यक्ति या sgs1 तब्दील या sgs1 TOP3 उपभेदों में WRN वेरिएंट का निर्धारण करने के लिए, lysates निम्न विधि और immunblotting द्वारा विश्लेषण प्रोटीन के द्वारा तैयार किए गए थे.

  1. रूपांतरित sgs1 या sgs1 TOP3 उपभेदों अनुसूचित जाति आरएएफ शून्य टीआरपी में 30 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए बड़े हो रहे थे.
  2. संस्कृतियों reinoculated थे और 30 में incubated ° सी जल्दी लॉग चरण (0.5 600 आयुध डिपो - 0.8), जब तक और फिर 2% की अंतिम एकाग्रता के लिए लड़की जोड़कर प्रेरित . संस्कृतियों को तो 30 से बढ़ने की अनुमति दी गई ° 6 एच. के लिए सी
  3. कक्ष (3 एमएल) centrifugation द्वारा एकत्र किए गए थे और पीबीएस के साथ धोया. सेल गोली क्षारीय lysis बफर में resuspended NaOH [50 मिमी, 10.5 पीएच, 2 मिमी EDTA, 1 मिमी phenylmethylsulfonyl (PMSF) फ्लोराइड, 2% एसडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 5% 2 mercaptoethanol और protease inhibitors (Roche आण्विक बायोकेमिकल्स)] , 5 मिनट, centrifugation द्वारा स्पष्ट के लिए उबला हुआ, और एम 1 एचसीएल के साथ neutralized है.
  4. सेल lysate के बराबर मात्रा में प्रोटीन 8-16% polyacrylamide एसडीएस जैल पर सुलझाया गया.

2. Galactose के अलग सांद्रता के प्रभाव के तहत WRN प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए, संस्कृतियों के रूप में संसाधित किया गया.

  1. 30 ° C पर रात भर के लिए अनुसूचित जाति आरएएफ शून्य टीआरपी में तब्दील sgs1 TOP3 उपभेदों बड़े हो रहे थे.
  2. संस्कृतियों reinoculated थे incubated डिग्री सेल्सियस तक जल्दी लॉग चरण (0.5 600 आयुध डिपो - 0.8) 30 में गा जोड़ने के द्वारा और फिर प्रेरित2% की अंतिम एकाग्रता के लिए मैं. संस्कृतियों को तो 30 से बढ़ने की अनुमति दी गई ° 6 एच. के लिए सी
  3. कक्ष centrifugation द्वारा काटा गया और बफर में resuspended (50 Tris सीएल मिमी, 7.5 पीएच, 1% सोडियम deoxycholate, 1% Triton एक्स 100, 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस]) युक्त protease inhibitors (0.05% PMSF, 0.05 μg / एमएल leupeptin).
  4. ग्लास मनकों (425 से 600 सुक्ष्ममापी) मिश्रण को जोड़ा गया था, और कोशिकाओं vortexing द्वारा टूट रहे थे.
  5. परिणामस्वरूप homogenate 5 मिनट के लिए XG 15000 पर centrifuged था और सतह पर तैरनेवाला अंश एकत्र किया गया था.
  6. Lysate भिन्न में प्रोटीन ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा अनुमान लगाया गया था.
  7. अलग lysate भिन्न से प्रोटीन की समान एकाग्रता 8-16% polyacrylamide एसडीएस जैल पर हल किया गया था.

3. WRN या WRN उत्परिवर्ती प्रोटीन की अभिव्यक्ति पश्चिमी धब्बा एक WRN माउस मोनोक्लोनल WRN के एक शुद्ध सी - टर्मिनल टुकड़ा में एक मिलान के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग द्वारा निर्धारित किया गया था [6] (1:1000, स्प्रिंग वैली लैब्स).

4. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन ऊष्मायन द्वारा एक माध्यमिक एंटीबॉडी (हॉर्सरैडिश संयुग्मित peroxidase) (1:5000) के साथ पीछा किया गया था. Blots एक ईसीएल प्लस निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पश्चिमी पहचान प्रणाली के साथ प्रोसेस किया गया.

5. मात्रात्मक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, ऐसी है कि दाग की मात्रा का ठहराव पर एक मानक रैखिक वक्र उत्पन्न किया जा सकता जैल पर उनकी टैग WRN पूर्ण लंबाई प्रोटीन शामिल थे पुनः संयोजक शुद्ध की सांद्रता बढ़ रही है . इसके अलावा, खमीर lysate नमूने की या 20 μg कोशिकाओं के बराबर राशि से सेल निकालने जैल पर लोड थे WRN की एकाग्रता का अनुमान है.

6. ImageQuant विश्लेषण तो जैल और मानक रैखिक वक्र पर प्रदर्शन किया गया था उत्पन्न.

7. WRN प्रोटीन के अलग लड़की सांद्रता में एकाग्रता मानक रैखिक ऊपर उत्पन्न वक्र का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था.

8. प्रतिनिधि परिणाम

इस अध्ययन में इस्तेमाल उपभेदों टीआरपी auxotrophs हैं. इसलिए, sgs1, TOP3 sgs1 और जंगली प्रकार W303-1A YEp112SpGAL या YEp112SpGAL - WRN के साथ तब्दील उपभेदों उनके लिए अनुसूचित जाति शून्य टीआरपी मीडिया की उपस्थिति में विकसित करने की क्षमता के आधार पर चयन किया गया था . तब्दील sgs1 TOP3 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास पर WRN अभिव्यक्ति की प्रभाव की जांच करने के लिए, संस्कृतियों 2% की लड़की के साथ अनुसूचित जाति शून्य टीआरपी मीडिया युक्त WRN अभिव्यक्ति प्रेरित प्लेटों पर रेखादार थे. TOP3 decatenates डीएनए [1, 2] प्रतिकृति के दौरान Sgs1 helicase द्वारा उत्पन्न अणुओं intertwined, इसलिए TOP3 के अभाव में, मरोड़ तनाव धीमी गति से विकास और अति पुनर्संयोजन में जिसके परिणामस्वरूप नहीं राहत मिली है. sgs1 की आनुवंशिक समारोह TOP3 उत्परिवर्ती की धीमी गति से विकास phenotype को दबाने के लिए है. यदि WRN SGS1 के लिए आनुवंशिक बातचीत में TOP3 के साथ विकल्प हो सकता है, TOP3 sgs1 TOP3 में धीमी गति से विकास phenotype की बहाली की उम्मीद होगी.

के रूप में चित्र 2A में दिखाया गया है, WRN तब्दील sgs1 TOP3 तनाव काफी अधिक धीरे धीरे की तुलना में बढ़ी वेक्टर sgs1 TOP3 तनाव तब्दील TOP3 sgs1 YEp112SpGAL SGS1 एक सकारात्मक नियंत्रण (2A चित्रा) के रूप में प्लाज्मिड शामिल किया गया था के साथ तब्दील हो, कि जंगली प्रकार का प्रदर्शन Sgs1 sgs1 TOP3 उत्परिवर्ती में व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक विकास phenotype पूरक करने में सक्षम था. तब्दील sgs1 TOP3 उपभेदों लड़की की अनुपस्थिति में इसी तरह वृद्धि हुई के रूप में 2 दिन (2A चित्रा) के लिए दिखाया गया है. WRN की अभिव्यक्ति माता पिता (W3031A) जंगली प्रकार या sgs1 उपभेदों (चित्रा 2B) के विकास पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, यह दर्शाता है कि सेल के विकास पर WRN के प्रभाव sgs1 TOP3 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में मनाया के लिए विशिष्ट था. आनुवंशिक अध्ययन WRN दिखा दिया कि WRN लेकिन exonuclease गतिविधि नहीं helicase TOP3 विकास phenotype (3B चित्रा) की बहाली के लिए आवश्यक था वेरिएंट का उपयोग कर प्रदर्शन किया . एक स्वाभाविक रूप से होने वाली WRN में missense बहुरूपता है कि helicase गतिविधि के साथ हस्तक्षेप TOP3 धीमी विकास phenotype बहाल करने की क्षमता समाप्त कर दिया.

TOP3 उत्परिवर्ती उपभेदों कोशिका चक्र की देर S/G2 चरण में देरी कर रहे हैं [1], एक विशेषता है कि उनके धीमी गति से विकास के लिए खाते सकता है. TOP3 पृष्ठभूमि में SGS1 जीन के उत्परिवर्तन कोशिका चक्र के S/G2 चरण में देरी को दबा . यदि WRN अभिव्यक्ति TOP3 sgs1 में कोशिका चक्र के S/G2 चरण में देरी को बहाल कर सकता है, अविभाजित नाभिक के साथ बड़े अंकुरित कोशिकाओं के एक ऊंचा आबादी sgs1 TOP3 उत्परिवर्ती WRN व्यक्त कोशिकाओं के लिए उम्मीद होगी. बड़े अंकुरित कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, sgs1 TOP3 TOP3 / sgs1 सदिश की तुलना में / WRN के लिए अधिक था, S/G2 डे की बहाली के सुझाव TOP3 की विशेषता रखना.

sgs1 TOP3 डबल उत्परिवर्ती कम TOP3 एकल [2] उत्परिवर्ती से एमएमएस या एच यू के प्रति संवेदनशील है. WRN sgs1 TOP3 प्रभावित सेल के विकास के बाद से, हम अगले methylmethane (एमएमएस, एक alkylating एजेंट) sulfonate और (एच यू, एक प्रतिकृति अवरोध करनेवाला) sgs1 / TOP3 WRN प्रदर्शित दोनों दवाओं के लिए संवेदनशीलता TOP3 sgs1 तुलनीय hydroxyurea के लिए संवेदनशीलता पर उसके प्रभाव की जांच की / SGS1 (चित्रा 5). WRN वेरिएंट की जेनेटिक विश्लेषण से पता चला है कि WRN helicase / ATPase, लेकिन नहीं WRN exonuclease गतिविधि, एमएमएस और एच यू के लिए संवेदनशीलता पर उसके प्रभाव के लिए आवश्यक था.

चित्रा 1
चित्रा 1. कृपया YEp112SpGAL वेक्टर में क्लोनिंग / WRN WRN वेरिएंट के लिए योजनाबद्ध प्रस्तुति संख्या 1 के एक बड़े संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 sgs1 TOP3 में WRN अभिव्यक्ति TOP3 की धीमी विकास phenotype restores कक्ष एक, sgs1 TOP3 YEp112SpGAL या YEp112SpGAL WRN के साथ तब्दील तनाव एक अनुसूचित जाति टीआरपी युक्त थाली या तो 2% glu या 2% लड़की पर रेखादार थे. किसी नियंत्रण के रूप में sgs1 TOP3 YEp112SpGAL SGS1 के साथ बदल तनाव दोनों प्लेटों पर रेखादार था. प्लेट्स 2 दिनों के लिए 30 ° C पर incubated रहे थे और तब फोटो खिंचवाने पैनल बी, जंगली प्रकार माता पिता W303-1A तनाव या sgs1 तनाव YEp112SpGAL या YEp112SpGAL WRN के साथ बदल रहे थे या तो glu 2% या 2% लड़की युक्त एक थाली अनुसूचित जाति टीआरपी पर रेखादार . प्लेट्स 30 ° C से कम 4 दिनों के लिए incubated रहे थे और तब फोटो खिंचवाने. प्लेटों की संरचना के रूप में कक्ष में एक और पैनल बी क्रमशः था. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 3
चित्रा 3. WRN ATPase / helicase, लेकिन, exonuclease गतिविधि नहीं sgs1 TOP3 पृष्ठभूमि में TOP3 की धीमी विकास phenotype बहाल करने की आवश्यकता है sgs1 TOP3 तनाव / ATPase helicase मृत (YEp195SpGAL WRN K577M) के साथ बदल exonuclease मृत (YEp195SpGAL. WRN E84A), RQC (YEp195SpGAL - WRN K1016A) उत्परिवर्ती, या उत्परिवर्ती बहुरूपी (R834C YEp195SpGAL - WRN) अनुसूचित जाति - टीआरपी या तो 2% glu (पैनल सी) या 2% लड़की (पैनल बी) युक्त प्लेटों पर रेखादार था . प्लेट्स 30 ° C पर 2 दिनों के लिए incubated रहे थे और तब फोटो खिंचवाने. प्लेटों की संरचना के रूप में पैनल ए में था कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 3 का एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 4
चित्रा 4 WRN अभिव्यक्ति sgs1 TOP3 कोशिकाओं में S/G2 गिरफ्तारी लाती sgs1 TOP3 YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, या YEp112SpGAL SGS1 के साथ तब्दील तनाव के लघुगणकीय बढ़ रही संस्कृतियों, और 2% की लड़की एकाग्रता में वेक्टर तब्दील जंगली प्रकार माता - पिता तनाव प्रेरित थे 6 एच. के लिए संस्कृतियों काटा गया, DAPI धुंधला के रूप में सामग्री और तरीके में वर्णित के लिए संसाधित थे और Axiovert 200 एम खुर्दबीन (Zeiss, 100x लेंस) का उपयोग कर मनाया. Sgs1 YEp112SpGAL (ऊपरी बाएँ) के साथ बदल TOP3 और DAPI YEp112SpGAL WRN (ऊपरी सही) के साथ धुंधला हो जाना दिखाया गया है. तीर अविभाजित नाभिक के साथ कोशिकाओं दिखा. (एकल कक्षों) G1 और S/G2 (अंकुरित कोशिकाओं) में कोशिकाओं का वितरण कम पैनल में दिखाया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 4 का एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 5
चित्रा 5. WRN अभिव्यक्ति की sgs1 TOP3 तनाव के एमएमएस और एच यू संवेदनशीलता पर प्रभाव. लघुगणकीय sgs1 TOP3 YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN exonuclease मृत (E84A YEp112SpGAL WRN), ATPase / helicase मृत, (YEp112SpGAL WRN K577M) के साथ बदल तनाव की संस्कृतियों से बढ़ RQC उत्परिवर्ती (K1016A YEp112SpGAL - WRN), उत्परिवर्ती बहुरूपी (R834C YEp112SpGAL - WRN), YEp112SpGAL SGS1 और वेक्टर जंगली प्रकार तब्दील पैतृक उपभेदों SC-TRP glu या लड़की और या तो एमएमएस या एच यू वाले प्लेटों पर एक दस गुना धारावाहिक dilutions में देखा गया संकेत सांद्रता में. प्लेट्स में 30 ° फोटो खिंचवाने 2 (नियंत्रण प्लेटें) दिन और 4 दिन (एमएमएस और एच यू प्लेटें) के लिए सी और तब incubated रहे थे. कृपया9/1639fig5.jpg "> यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 5 का एक बड़ा संस्करण देख.

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Discussion

एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर का उपयोग कर की ताकत के एक परिभाषित डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत कि खमीर और मनुष्यों के बीच में संरक्षित कर रहे हैं रास्ते में म्यूटेंट की उपलब्धता है. विशिष्ट जीन शरण transformants के आगे चयन आसान और विश्वसनीय है के रूप में प्रयोगशाला उपभेदों और auxotrophic मार्कर के साथ auxotrophic म्यूटेंट वैक्टर हैं आसानी से उपलब्ध हैं. इन वैक्टर का उपयोग जीन उत्पादों की अभिव्यक्ति एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण (जैसे, लड़की inducible प्रमोटर, आदि) के तहत उन्हें रखने के द्वारा विनियमित किया जा सकता है है. इन फायदों को ध्यान में रखते हुए, हम एक खमीर आधारित मॉडल के लिए मानव WRN एक मार्ग है कि मानव और खमीर के बीच संभावित संरक्षित है वर्नर सिंड्रोम में दोषपूर्ण जीन की कार्यात्मक जरूरतों का अध्ययन प्रणाली विकसित की है. वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहला सबूत है कि WRN कि TOP3 से संबंधित phenotypes को प्रभावित करता है एक आनुवंशिक मार्ग में कार्य कर सकते हैं प्रदान की है. हमारी टिप्पणियों संभावना है कि WRN कार्यात्मक सेलुलर डीएनए प्रतिकृति या पुनर्संयोजन के दौरान मानव कोशिकाओं में Top3α के साथ सूचना का आदान प्रदान की आगे की जांच पड़ताल prompt. क़यास हालत BLM बिगड़ा में, WRN आंशिक रूप से इसकी एक topoisomerase के साथ प्रोटीन की भागीदारी के माध्यम से BLM लिए विकल्प हो सकता है.

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Acknowledgments

इस काम में पूर्ण NIH उम्र बढ़ने पर, राष्ट्रीय संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था. हम खमीर SGS1 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए और दबाव डा. ब्राड जॉनसन (चिकित्सा पेंसिल्वेनिया स्कूल विश्वविद्यालय, फिलाडेल्फिया, पेनसिल्वेनिया) के लिए डॉ. रॉडने रोथस्टीन (कोलंबिया विश्वविद्यालय) धन्यवाद.

References

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माइक्रोबायोलॉजी 37 अंक वर्नर सिंड्रोम helicase topoisomerase RecQ ब्लूम सिंड्रोम Sgs1 जीनोमिक अस्थिरता आनुवांशिकी डीएनए की मरम्मत खमीर
मानव डीएनए की मरम्मत प्रोटीन के आनुवंशिक अध्ययन एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर का उपयोग
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Aggarwal, M., Brosh Jr., R. M.… More

Aggarwal, M., Brosh Jr., R. M. Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System . J. Vis. Exp. (37), e1639, doi:10.3791/1639 (2010).

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