מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ"א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Summary

מחקרים גנטיים שמרים יכול להיות מועסק לחקור את הפונקציות מולקולרית תאית של הגנים האנושיים במטבוליזם DNA התאי. מתוארות שיטות לאפיון הגנטי של האדם

Abstract

הבנת תפקידם של החלבונים תיקון דנ"א אנושי במסלולים גנטי הוא אתגר עצום לחוקרים רבים. מחקרים גנטיים במערכות יונקים היה מוגבל בשל היעדר כלים זמינים כולל מוטציה קווים מוגדרים התא הגנטי, מערכות רגולטוריות הביטוי, וסמנים לבחירה המתאימה. כדי לעקוף את הקשיים הללו, מערכות מודל גנטי אאוקריוטים נמוך הפכו בחירה אטרקטיבית לחקר תפקודית נשמרת לתקן דנ"א וחלבונים המסלולים. פיתחנו מודל שמרים המערכת כדי ללמוד את פונקציות גנטי מוגדר היטב של תסמונת ורנר helicase-nuclease (

Protocol

1. זני שמרים

זנים עם wild-type SGS1 TOP3 (WT: W303-1A, גנוטיפ, מחצלת ade2-1 canl-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trpl-l ura3-1) [2], sgs1 מוטציה (W1292-3C ; גנוטיפ מחצלת SUP4-O:: URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) ו sgs1 top3 מוטציה (W1058-11C, גנוטיפ, MAT SUP4-O:: URA3 sgs1-25 top3-2:: HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) היה מאופיין [3] נמסרו חביב ד"ר רודני רוטשטיין (אוניברסיטת קולומביה).

2. פלסמיד דנ"א קונסטרוקציות

הגן WRN שוכפלה ב YEp112SpGAL בעקבות התוכנית כפי שנדון.

1. אתר מכוונת של מוטציות WRN (exonuclease E84A מת, K577M helicase מת, R834C ו K1016A) של פלסמיד YEp195SpGAL-WRN [4] נבנו באמצעות primers מוטגניות ואת הפרוטוקול הסטנדרטי של Quickchange II XL אתר מכוונת mutagenesis Kit (Stratagene) על ידי Lofstrand מעבדות (Gaithersburg, MD).
2. שברי DNA קידוד WRN וגירסאות המשויך היו מטוהרים ג'ל לאחר עיכול כפול עם סאל ואני Mlu I. מן YEp195SpGAL-WRN בונה בהתאמה
3. ג'ל שברי מטוהרים היו משובטים מכן לתוך אני סאל אתרים Mlu אני YEp112SpGAL של וקטור, 2 מיקרומטר רב עותק פלסמיד המכיל סמן TRP1 לבחירה לבנות WRN YEp112SpGAL או וריאנטים WRN בשליטת היזם גלאון ועין מתנהלת כפי שמוצג באיור 1 .
4. בונה שהושגו כך נקראו כמו YEp112SpGAL-WRN, YEp112SpGAL-WRN E84A, YEp112SpGAL-WRN K577M, YEp112SpGAL-WRN K1016A, ו-YEp112SpGAL WRN R834C.

3. טרנספורמציה

תרבויות שמרים גדלו באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי וטרנספורמציות בוצעו באמצעות Acetate מבוססי פרוטוקול ליתיום ידי Gietz ואח' [5]. בקצרה, השלבים הבאים בוצעו.

1. תרבויות של הזנים הנ"ל גדלו בין לילה ב 5 מ"ל YPD (תמצית שמרים, peptone-דקסטרוז) בינוני. תרבויות היו reinoculated במדיום YPD 50 מ"ל ו הורשו לצמוח עד OD של ₆₀₀ 1.0-1.2 הושג.
2. תרבויות נבצרו, נשטף במים 20 מ"ל, ו resuspended ב 1 מ"ל של ליתיום אצטט 100 מ"מ (LiAc). התאים הודגרו ב 30 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. תא גלולה היה resuspended ב LiAc 100 מ"מ עד נפח סופי של 500 μl, וזה מספיק כדי לעשות עשר טרנספורמציות. 50 μl של ההשעיה היה aliquoted תא ותא גלולה נאסף על ידי צנטריפוגה.
4. כדי התא גלולה נוספה לפי הסדר הבא: 50% 250 μl פוליאתילן גליקול (PEG), 36 μl של 1 M LiAc, 25 μl של ssDNA 2 מ"ג / מ"ל ​​(זרע DNA סלמון), 5 מ"ל של DNA פלסמיד (100 ng ng 1000), וכן 50 μl מים. תא גלולה היה vortexed דקות 1.
5. התאים הודגרו אז ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחריו הלם חום 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
6. תאים נקצרו resuspended במים 1 מ"ל. מאז YEp112SpGAL פלסמיד המכיל trp כסמן לבחירה, כל שמוטציות מחסה לבנות יהיה trp מיומן. לכן, transformants נבחרו על ידי ציפוי ההשעיה על SC (סינטטי מלא) מדיה גלוקוז חסר TRP ו דוגרים לוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים עד המושבות להופיע.

4. ניתוח גנטי של שיקום פנוטיפ איטי בצמיחה WRN הפך sgs1 top3 זן.

1. Streak ניתוח:

1. כדי לבחון את ההשפעה של הביטוי WRN על צמיחה של wild-type הורית (W303-1A), sgs1, או sgs1 top3 זנים, הזנים המתאימים עם YEp112SpGAL או YEp112SpGAL-WRN היו פסים על SC מינוס צלחות trp המכיל גם גלוקוז 2% ( glu) או 2% גלקטוז (גל). כמו שליטה, sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 נכלל. פלטות הודגרו ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
2. כדי לקבוע את היכולת של WRN להשפיע על קצב הצמיחה של זן top3 sgs1 בבית התחתון חלבון רמות WRN הביטוי, sgs1 top3 זן הפך עם YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN, או YEp112SpGAL-SGS1 היה מרוח על SC מינוס צלחות trp המכילה ריכוזים שונים של גל מ כמו 0.005% נמוך עד גבוה ככל 2%. פלטות הודגרו אז עבור 2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.
3. כדי להעריך את הדרישות הפונקציונליות של WRN לשחזר את הפנוטיפ צמיחה איטית ברקע top3 sgs1, sgs1 top3 הפך עם YEp112SpGAL-WRN (E84A, K577M, R834C ו K1016A) היו streaked לצלחות SC מינוס trp המכיל גם glu או גל בכל הריכוזים הצביעו. עבור פקדים, sgs1 top3 זן הפך עם YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN או YEp112Sp GAL-SGS1 נכלל. פלטות הודגרו אז עבור 2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.

2. תרבות נוזלי ניתוח:

1. כדי להעריך את הצמיחה של sgs1 top3 זנים הפך בתרבות נוזל, תאים שמרים גדלו SC RAF מינוס TRP ב 30 ° C במשך הלילה. תרבויות היו reinoculated ב SC RAF מינוס trp גדל בקצב של 30 ° C עד שלב להיכנס מוקדם (OD של ₆₀₀ ~ 0.5). תרבויות היו reinoculated אז OD _0.05 בתקשורת SC המכיל גל 2% וצמיחה בעקבות מדידת ספיגת על מרווחי הזמן המצוין.

5. ניתוח גנטי של hydroxyurea או methylmethane-sulfonate רגישות WRN הפך זני שמרים.

1. כדי לקבוע את ההשפעה של הביטוי WRN על רגישות MMS ו HU של sgs1 או sgs1 top3 זני, זני הפך עם YEp112SpGAL או YEp112SpGAL-WRN גדלו SC RAF מינוס TRP ב 30 ° C.
2. תרבויות היו reinoculated ב SC RAF מינוס trp גדל בקצב של 30 ° C עד שלב להיכנס מוקדם (OD של ₆₀₀ ~ 0.6-0.8).
3. פי עשרה דילולים הסידורי של זנים אלה הוכנו באמצעות מדיום SC חסר TRP. מתוך התרבות גדל באופן אקספוננציאלי, 5 x 10 ⁶ תאים נלקחו בדילול סדרתי עד פי 10,000. ארבעה מיקרוליטר של דילול כל זוהה על SC גל צלחות מינוס trp המכיל ריכוזי המצוין של האוניברסיטה העברית או MMS. פלטות הודגרו ב 30 ° C.
4. כמו שליטה, wild-type זן הורית (W303-1A) הפך עם YEp112SpGAL או YEp112SpGAL-WRN, או sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 טופל כפי שתואר לעיל.

6. מחזור התא חלוקת WRN הפך sgs1 top3 זן.

1. כדי לחקור את מחזור התא חלוקת WRN הפך sgs1 top3 זן, תרבויות sgs1 top3 הפך עם YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN, או YEp112SpGAL-SGS1, ואת וקטור הפך wild-type זן הורית (W303-1A) גדלו ב SC RAF מינוס trp על 30 מעלות צלזיוס למשך לילה.
2. תרבויות היו reinoculated ב OD _0.05 ואיפשר לצמוח til שלב להיכנס מוקדם (OD ₆₀₀ של 0.5 -0.6). הביטוי WRN היה המושרה על ידי הוספת גל הריכוז הסופי של 2%. תרבויות הורשו אז לצמוח בקצב של 30 מעלות צלזיוס במשך 6 ח
3. תרבויות עובדו ואז DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) מכתים.
   1. תרבויות נקצרו על ידי צנטריפוגה XG ב 5800 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   2. תאים נשטפו פעם עם 1X פוספט בופר סליין (PBS) וכן נקבעו אז בשביל 20 דקות ב RT באתנול 70%.
   3. תאים קבוע נשטפו פעמיים עם 1 X PBS, ו resuspended לבסוף 1X PBS.
4. תאים הונחו על שקופיות רכוב Vectashield הרכבה בינונית עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) (Vector, ארה"ב). תאים שנבדקו עם מיקרוסקופ 200 Axiovert M (Zeiss, עדשת 100x) ואת ההפרש המשולב לעומת התערבות (DIC). תמונות Fluorescence נותחו באמצעות AxioVision, גרסה 3.0 התוכנית (Zeiss).

7. המערב מנתח כתם.

1. כדי לקבוע את הביטוי של חלבון WRN או וריאנטים WRN ב sgs1 טרנספורמציה או sgs1 top3 זנים, lysates הוכנו לפי השיטה הבאה וחלבונים ונותחו על ידי immunblotting.

1. שינו sgs1 או sgs1 top3 זנים גדלו SC RAF מינוס TRP ב 30 מעלות צלזיוס למשך לילה.
2. תרבויות היו reinoculated וטופחו על 30 מעלות צלזיוס עד שלב להיכנס מוקדם (OD ₆₀₀ של 0.5-0.8) ולאחר מכן המושרה על ידי הוספת גל הריכוז הסופי של 2%. תרבויות הורשו אז לצמוח בקצב של 30 מעלות צלזיוס במשך 6 ח
3. תאים (3 מ"ל) נאספו על ידי צנטריפוגה ורחץ עם PBS. תא גלולה היה resuspended במאגר תמוגה אלקליין [50 mM NaOH, pH 10.5, 2 mM EDTA, 1 phenylmethylsulfonyl mM פלואוריד (PMSF), 2% SDS, גליצרול 10%, 5% ו - 2-mercaptoethanol מעכבי פרוטאז (ביוכימיקלים רוש מולקולרית)] , מבושל במשך 5 דקות, הבהיר ידי צנטריפוגה, ואת לנטרל עם 1 M HCl.
4. חלבונים מן הסכומים המקבילה של lysate תא נפתרו על ג'לים polyacrylamide 8-16% SDS.

2. כדי לקבוע את רמת הביטוי של חלבון WRN תחת השפעת ריכוזים שונים של גלקטוז, תרבויות עובדו כדלקמן.

1. שינו sgs1 top3 זנים גדלו SC RAF מינוס TRP ב 30 מעלות צלזיוס למשך לילה.
2. תרבויות היו reinoculated וטופחו על 30 מעלות צלזיוס עד שלב להיכנס מוקדם (OD ₆₀₀ של 0.5-0.8) ו המושרה אז על ידי הוספת gaאני הריכוז הסופי של 2%. תרבויות הורשו אז לצמוח בקצב של 30 מעלות צלזיוס במשך 6 ח
3. תאים נקצרו על ידי צנטריפוגה ו resuspended במאגר (50 mM טריס-Cl, pH 7.5, deoxycholate נתרן 1%, 1% Triton X-100, נתרן גופרתי 0.1% dodecyl [SDS]) המכיל מעכבי פרוטאז (0.05% PMSF, 0.05 מיקרוגרם / ml leupeptin).
4. חרוזי זכוכית (425 עד 600 מיקרומטר) נוספו לתערובת, והתאים נשברו על ידי vortexing.
5. Homogenate שהתקבל היה centrifuged במשך 5 דקות על XG 15000 ואת חלק supernatant נאסף.
6. חלבון של שברים lysate נאמד לפי שיטת ברדפורד.
7. ריכוז שווה של חלבון מן שברים lysate שונים נפתרה על ג'לים polyacrylamide 8-16% SDS.

3. ביטוי של חלבונים WRN או WRN מוטציה נקבע על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדנים חד שבטיים עכבר WRN נגד epitope בקטע מטוהרים C-טרמינל של WRN [6] (1:1000, עמק המעיינות Labs).

4. הדגירה נוגדן ראשוני בעקבות הדגרה עם נוגדן (חזרת peroxidase-מצומדות) משני (1:5000). כתמים עובדו עם מערכת זיהוי ECL פלוס המערבי לכל פרוטוקול של היצרן.

5. לניתוח כמותי כתם המערבי, להגדיל ריכוזים של מטוהרים רקומביננטי-tagged שלו באורך מלא חלבון WRN נכללו ג'ל כזה על כימות של כתם עקומה ליניארית רגיל יכול להיות שנוצר. יתר על כן, תמצית התא כמות זהה של תאים או 20 מיקרוגרם של דגימות lysate שמרים הועמסו על ג'לים לאמוד את ריכוז WRN.

6. ניתוח ImageQuant בוצעה אז על ג'לים עקומה ליניארית תקן נוצר.

7. ריכוז החלבון WRN בריכוזים משתנים גל נאמדה באמצעות עקומה ליניארית תקן שנוצר לעיל.

8. נציג תוצאות

כל הזנים המשמשים במחקר זה הם auxotrophs TRP. לכן, sgs1, sgs1 top3 וסוג בר W303-1A זנים הפך עם YEp112SpGAL או YEp112SpGAL-WRN נבחרו על בסיס יכולתם לגדול בנוכחות של SC מינוס trp התקשורת. כדי לבחון את ההשפעה של הביטוי WRN על צמיחה של טרנספורמציה sgs1 top3 תאים מוטנטים, תרבויות היו פסים על צלחות המכילות SC מינוס trp התקשורת עם גל 2% כדי לגרום ביטוי WRN. Top3 decatenates שלובים זה בזה מולקולות ה-DNA שנוצר על ידי helicase Sgs1 במהלך שכפול [1, 2], ולכן, בהעדר Top3, מתח torsional לא הקלה וכתוצאה מכך גידול איטי יתר רקומבינציה. הפונקציה הגנטי של sgs1 היא לדכא את הפנוטיפ צמיחה איטית של מוטציה top3. אם WRN יכול תחליף SGS1 באינטראקציה עם Top3 גנטית, שיקום פנוטיפ top3 צמיחה איטית sgs1 top3 שניתן היה לצפות.

כפי שמוצג בתרשים 2A, WRN הפך sgs1 top3 זן גדל באופן משמעותי בהשוואה לאט יותר כדי וקטור הפך sgs1 top3 זן. Sgs1 top3 הפך עם YEp112SpGAL-SGS1 פלסמיד נכלל כביקורת חיובית (איור 2 א), הוכחת כי wild-type Sgs1 לידי ביטוי sgs1 top3 מוטציה גנטית היה מסוגל להשלים את הפנוטיפ צמיחה. הפכו sgs1 top3 זנים גדל באופן דומה בהיעדר גל כפי שמוצג עבור 2 ימים (איור 2 א). הביטוי של WRN לא היתה כל השפעה על הצמיחה של זנים wild-type (W3031A) או sgs1 הורית (תרשים 2B), המציין את ההשפעה של WRN על צמיחת תאים ספציפיים היה לזה שנצפה ברקע top3 sgs1 מוטציה. מחקרים גנטיים שבוצעו באמצעות גרסאות WRN הוכיח כי WRN helicase אך לא פעילות exonuclease נדרש לשיקום פנוטיפ top3 צמיחה (איור 3B). פולימורפיזם missense באופן טבעי WRN המפריע לפעילות helicase ביטל את יכולתו לשחזר top3 פנוטיפ צמיחה איטית.

top3 שמוטציות מעוכבים בשלב S/G2 מאוחר של מחזור התא [1], מאפיין זה עשוי להסביר את הגידול האיטי שלהם. מוטציה של הגן SGS1 ברקע top3 מדכא את העיכוב בשלב S/G2 של מחזור התא. אם הביטוי WRN יכול לשחזר את עיכוב S/G2 שלב של מחזור התא sgs1 top3, אוכלוסייה גבוהות של תאים מנוצן גדול עם גרעינים מחולקת שאפשר לצפות sgs1 top3 תאים מוטנטים להביע WRN. כפי שמוצג באיור 4, אחוז התאים מנוצן גדול היה גבוה יותר עבור WRN sgs1 / top3 מאשר sgs1 top3 / וקטור, מה שמרמז על שיקום של דה S/G2 שכבה אופייני top3.

Sgs1 top3 כפול מוטציה רגישה פחות MMS או HU יותר top3 מוטציה אחת [2]. מאז צמיחת תאים WRN המושפעות של sgs1 top3, אנחנו הבא בדק את השפעתו על רגישות sulfonate methylmethane (MMS, סוכן אלקילציה) ו hydroxyurea (האוניברסיטה העברית, מעכב שכפול). Sgs1 top3 / WRN רגישות המוצגות הן תרופות להשוות sgs1 top3 / SGS1 (איור 5). ניתוח גנטי של וריאנטים WRN גילה כי WRN helicase / ATPase, אך לא פעילות exonuclease WRN, היה נדרש והשפעתה על רגישות MMS, האוניברסיטה העברית.

באיור 1. מצגת Schematic עבור גרסאות שיבוט WRN / WRN ב וקטור YEp112SpGAL. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. הביטוי WRN ב sgs1 top3 משחזר את הפנוטיפ צמיחה איטית של top3. Panel, sgs1 top3 זן הפך עם YEp112SpGAL או YEp112SpGAL WRN היו מפוספס על הצלחת SC-TRP המכיל גם glu 2% או גל 2%. כביקורת sgs1 top3 זן הפך עם YEp112SpGAL SGS1 היה מפוספס משני הלוחות. פלטות הודגרו ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים וצילם אז. לוח ב ', זן פראי סוג של ההורים W303-1A או זן sgs1 הפך עם YEp112SpGAL או WRN YEp112SpGAL היו מפוספס על הצלחת SC-TRP או glu המכילה 2% או 2% gal . פלטות הודגרו ב 30 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים וצילם אז. הרכב הצלחות היה בלוח A ו-B לוח בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

איור 3. WRN ATPase / helicase, אך לא פעילות exonuclease, נדרש לשחזר את הפנוטיפ צמיחה איטית של top3 ברקע top3 sgs1. Sgs1 top3 זן הפך עם ATPase / helicase מת (YEp195SpGAL WRN K577M), exonuclease מת (YEp195SpGAL- WRN E84A), RQC מוטציה (YEp195SpGAL-WRN K1016A), או צורות מוטציה (YEp195SpGAL-WRN R834C) היה מפוספס על SC-TRP צלחות המכילות גם glu 2% (לוח ג) או 2% gal (לוח ב '). פלטות הודגרו ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים וצילם אז. הרכב הצלחות היה כמו בלוח א אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 3.

איור 4. הביטוי WRN גורם S/G2 מעצר sgs1 top3 תאים. תרבויות בטור לוגריתמי גדל והולך של זן top3 sgs1 הפך עם YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, או YEp112SpGAL SGS1, ואת וקטור הפך wild-type זן ההורים היו המושרה בריכוז גל 2% עבור 6 ח תרבויות נבצרו, מעובד על מכתים DAPI כמתואר חומרים ושיטות ו נצפו באמצעות מיקרוסקופ Axiovert 200 M (Zeiss, עדשת 100x). מוצג הוא מכתים DAPI של top3 sgs1 הפך עם (למעלה משמאל) YEp112SpGAL ועם YEp112SpGAL WRN (הימנית העליונה). חצים מראים תאים עם גרעינים מחולקת. חלוקת התאים G1 (תאים בודדים) ו S/G2 (תאים מנוצן) מוצג בלוח התחתון. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.

איור 5. השפעת ביטוי WRN על רגישות MMS ו HU של זן top3 sgs1. בטור לוגריתמי גדל תרבויות של זן top3 sgs1 הפך עם YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, exonuclease מת (YEp112SpGAL-WRN E84A), ATPase / helicase מת (YEp112SpGAL WRN K577M), RQC מוטציה (YEp112SpGAL-WRN K1016A), צורות מוטציה (YEp112SpGAL-WRN R834C), הפך YEp112SpGAL SGS1 ו וקטור סוג בר הזנים ההורים היו הבחין פי עשרה דילולים סדרתי על SC-TRP צלחות המכילות glu או גל או MMS או HU בכל הריכוזים הצביעו. פלטות הודגרו ב 30 ° C צילם עבור 2 ימים (לוחות בקרה) ו 4 ימים (MMS וצלחות HU) ולאחר מכן. בבקשה9/1639fig5.jpg "> לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 5.

Discussion

אחד היתרונות של שימוש בשמרים כמודל למערכת הוא הזמינות של מוטציות בשכפול הדנ"א מוגדרים מסלולי תיקון אשר נשמרת בין שמרים ובני אדם. מבחר נוסף של transformants מחסה גנים ספציפיים קל ואמין כמו זנים במעבדה הם מוטנטים auxotrophic ו וקטורים עם סמנים auxotrophic זמינים. שימוש אלה וקטורים הביטוי של מוצרים גן יכול להיות מוסדר על ידי הצבתם בשליטת היזם ועין מתנהלת (למשל, מקדם גל ועין מתנהלת וכו '). לאור יתרונות אלה, פיתחנו מודל מבוסס מערכת שמרים ללמוד את הדרישות הפונקציונליות של הגן WRN אדם פגום תסמונת ורנר במסלול כי נשמרת פוטנציאלי בין אדם שמרים. שימוש בגישות שתוארו, סיפקנו את ההוכחה הראשונה לכך WRN יכול לתפקד במסלול גנטית המשפיעה top3 הקשורות פנוטיפים. התצפיות שלנו הפקודה חקירה נוספת של האפשרות WRN תפקודית אינטראקציה עם Top3α בתאים אנושיים במהלך שכפול הדנ"א רקומבינציה או הסלולר. מתקבל על הדעת, במצב BLM-לקוי, WRN עשוי חלקית תחליף BLM באמצעות השותפות שלה עם חלבון topoisomerase.