Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Summary

Gli studi genetici nel lievito può essere impiegato per studiare le funzioni cellulari e molecolari dei geni umani nel metabolismo del DNA cellulare. I metodi sono descritti per la caratterizzazione genetica della persona umana

Abstract

Comprendere il ruolo delle proteine ​​di riparazione del DNA umano nei percorsi genetica è una sfida formidabile per molti ricercatori. Studi genetici nei sistemi di mammiferi sono stati limitati a causa della mancanza di strumenti facilmente reperibili anche definito le linee di cellule mutanti genetici, sistemi di espressione normativi e appropriati marcatori selezionabili. Per aggirare queste difficoltà, sistemi modello genetico in eucarioti inferiori sono diventati una scelta interessante per lo studio delle proteine ​​DNA funzionalmente conservato riparazione e percorsi. Abbiamo sviluppato un sistema di lievito modello per studiare le funzioni mal definiti genetici della sindrome di Werner elicasi-nucleasi (

Protocol

1. Ceppi di lievito

I ceppi di tipo selvaggio SGS1 TOP3 (WT; W303-1A, genotipo, MAT uno ade2-1 LCan-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRPL-l ura3-1) [2], un sgs1 mutante (W1292-3C ; genotipo MAT uno SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 ade2-1 CAN1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRP1-1 ura3-1 rad5-535) ed una top3 sgs1 mutante (W1058-11C, genotipo, MAT uno SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 top3-2:: HIS3 ade2-1 CAN1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRP1-1 ura3-1 rad5-535) sono stati caratterizzati [3] e sono stati gentilmente forniti dal Dr. Rodney Rothstein (Columbia University).

2. Costruzioni DNA plasmidico

Il gene WRN è stato clonato nel YEp112SpGAL secondo lo schema come discusso.

1. Sito-diretta di mutazioni WRN (esonucleasi E84A morti, K577M elicasi morti, R834C, e K1016A) nel plasmide YEp195SpGAL-WRN [4] sono stati costruiti utilizzando primer mutageno e un protocollo standard da QuickChange II XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene) dai laboratori Lofstrand (Gaithersburg, MD).
2. Frammenti di DNA codifica WRN e le sue varianti associate gel sono stati purificati dalle rispettive YEp195SpGAL-WRN costruisce dopo la digestione doppia con Sal I e Mlu I.
3. Gel frammenti purificati sono stati poi clonato in I Sal Mlu I siti del vettore YEp112SpGAL, a 2 micron multi-copia TRP1 plasmide contenente un marcatore per costruire YEp112SpGAL WRN o varianti WRN sotto il controllo di una ragazza-inducibile promotore, come mostrato nella Figura 1 .
4. I costrutti così ottenuti sono stati chiamati come YEp112SpGAL-WRN, YEp112SpGAL-WRN E84A, YEp112SpGAL-WRN K577M, YEp112SpGAL-WRN K1016A e YEp112SpGAL-WRN R834C.

3. Trasformazione

Lieviti sono state coltivate utilizzando il protocollo standard e le trasformazioni sono state effettuate utilizzando un acetato a base di litio da protocollo Gietz et al [5]. In sintesi, le seguenti operazioni sono state eseguite.

1. Culture dei ceppi di cui sopra sono stati coltivati ​​durante la notte in 5 ml YPD (estratto di lievito-peptone-destrosio) medio. Culture erano reinoculated in 50 ml di mezzo YPD e sono stati autorizzati a crescere fino ad un diametro esterno ₆₀₀ di 1,0-1,2 è stato raggiunto.
2. Le culture sono state raccolte, lavate con 20 ml di acqua, e risospeso in 1 ml di 100 mM acetato di litio (LIAC). Le cellule sono state incubate a 30 ° C per 10 min.
3. Pellet cellulare è stato risospeso in 100 LIAC mm ad un volume finale di 500 microlitri, che è abbastanza per fare dieci trasformazioni. 50 ml di sospensione cellulare è stato aliquotati e pellet cellulare è stato raccolto per centrifugazione.
4. Per il pellet è stato aggiunto nel seguente ordine: 250 Polietilenglicole microlitri 50% (PEG), 36 ml di 1 M LIAC, 25 ml di 2 mg / ml ssDNA (DNA spermatico salmone), 5 ml di DNA plasmidico (100 ng 1000 ng), e 50 microlitri di acqua. Pellet cellulare è stato in agitazione per 1 min.
5. Le cellule sono state poi incubate a 30 ° C per 30 minuti seguita da uno shock di calore a 42 ° C per 20 min.
6. Le cellule sono state raccolte e risospese in 1 ml di acqua. Poiché il YEp112SpGAL plasmide contiene trp come marcatore di selezione, tutti i ceppi mutanti ospitare il costrutto sarebbe trp abili. Pertanto, trasformanti sono stati selezionati dalla placcatura la sospensione su SC (Synthetic completo) i media del glucosio manca Trp e incubando le piastre a 30 ° C per 3-4 giorni fino a quando le colonie appaiono.

4. L'analisi genetica del restauro fenotipo lenta crescita WRN trasformato sgs1 top3 ceppo.

1. Streak analisi:

1. Per esaminare l'effetto di espressione WRN sulla crescita delle wild-type dei genitori (W303-1A), sgs1 o sgs1 top3 ceppi, i ceppi corrispondente YEp112SpGAL o YEp112SpGAL-WRN erano striati in SC meno piatti Trp contenente sia glucosio al 2% ( glu) o 2% galattosio (gal). Come controllo, sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 è stato incluso. Piastre sono state incubate a 30 ° C per 2 giorni.
2. Per determinare la capacità di WRN di influenzare il tasso di crescita del sgs1 top3 ceppo a livelli più bassi di proteine ​​WRN espressione, il sgs1 top3 ceppo trasformato con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN, o YEp112SpGAL-SGS1 era striato in SC meno piatti Trp contenenti concentrazioni variabili di gal da pari a 0.005% a un massimo del 2%. Piastre sono state poi incubate a 30 ° C per 2 giorni.
3. Per valutare i requisiti funzionali di WRN per ripristinare il fenotipo lenta crescita della top3 sgs1 sfondo, sgs1 top3 trasformato con YEp112SpGAL-WRN (E84A, K577M, R834C, e K1016A) sono stati Streaked su piastre SC meno Trp contenente sia glu o ragazza alle concentrazioni indicate. Per i controlli, sgs1 top3 ceppo trasformato con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN o YEp112Sp GAL-SGS1 è stato incluso. Piastre sono state poi incubate a 30 ° C per 2 giorni.

2. Cultura analisi dei liquidi:

1. Per valutare la crescita di trasformarsi sgs1 top3 ceppi in coltura liquida, cellule di lievito sono state coltivate in SC raf meno Trp a 30 ° C durante la notte. Culture erano reinoculated in SC raf meno Trp e cresciuto a 30 ° C alla fase log precoce (diametro esterno ₆₀₀ di ~ 0,5). Le culture sono state poi reinoculated a OD _0,05 in media SC contenente il 2% gal e la crescita è stata seguita da misurare l'assorbanza a intervalli di tempo indicato.

5. L'analisi genetica di idrossiurea o methylmethane-solfonato sensibilità WRN trasformato ceppi di lievito.

1. Per determinare l'effetto di espressione WRN sulla sensibilità MMS e HU di sgs1 o sgs1 top3 ceppi, ceppi trasformati con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL-WRN sono state coltivate in SC raf meno Trp a 30 ° C.
2. Culture erano reinoculated in SC raf meno Trp e cresciuto a 30 ° C alla fase log precoce (diametro esterno ₆₀₀ di ~ 0.6 a 0.8).
3. Diluizioni seriali dieci volte di questi ceppi sono stati preparati utilizzando medio SC mancano Trp. Da una cultura in crescita esponenziale, 5 x 10 ⁶ cellule sono state prese e diluito serialmente fino a 10.000 volte. Quattro microlitri di ciascuna diluizione è stato avvistato in SC gal meno piatti Trp contenenti concentrazioni indicate di HU o MMS. Piastre sono state incubate a 30 ° C.
4. Come controllo, wild-type ceppo parentale (W303-1A) trasformato con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL-WRN, o sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 è stato trattato come descritto sopra.

6. Ciclo di distribuzione delle cellule di WRN trasformato sgs1 top3 ceppo.

1. Per studiare la distribuzione del ciclo cellulare di WRN trasformato sgs1 top3 ceppo, colture di sgs1 top3 trasformato con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN, o YEp112SpGAL-SGS1, e il vettore-trasformata wild-type ceppo parentale (W303-1A) sono state coltivate in SC raf meno trp a 30 ° C per il pernottamento.
2. Culture erano reinoculated a OD _0,05 e ha permesso di crescere finchè fase di crescita precoce (diametro esterno ₆₀₀ di 0,5 -0,6). WRN espressione è stata indotta con l'aggiunta di gal al 2% di concentrazione finale. Le culture sono stati poi permesso di crescere a 30 ° C per 6 h.
3. Le culture sono stati poi elaborati per DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) colorazione.
   1. Le culture sono state raccolte mediante centrifugazione a 5800 xg per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
   2. Le cellule sono state lavate una volta con 1X tampone fosfato salino (PBS) e sono stati poi fissati in etanolo al 70% per 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Cellule fissate sono state lavate due volte con 1 X PBS, e infine risospesi in PBS 1X.
4. Le cellule sono state immesse sul vetrino e montati in Vectashield montaggio mezzo con DAPI (1 mg / ml) (Vector, USA). Le cellule sono state esaminate con un microscopio Axiovert 200 M (Zeiss, lente 100x) e composito contrasto di interferenza differenziale (DIC). Immagini di fluorescenza sono stati analizzati utilizzando AxioVision, la versione 3.0 del programma (Zeiss).

7. Western Blot analisi.

1. Per determinare l'espressione della proteina WRN o le varianti WRN in sgs1 trasformato o sgs1 top3 ceppi, lisati sono stati preparati con il metodo seguito e le proteine ​​analizzate da immunblotting.

1. Trasformato sgs1 o sgs1 top3 ceppi sono stati coltivati ​​in SC raf meno Trp a 30 ° C per il pernottamento.
2. Culture erano reinoculated e incubate a 30 ° C fino alla fase di crescita precoce (diametro esterno ₆₀₀ di 0,5 - 0,8) e poi indotta con l'aggiunta di gal al 2% di concentrazione finale. Le culture sono stati poi permesso di crescere a 30 ° C per 6 h.
3. Cells (3 ml) sono stati raccolti per centrifugazione e lavate con PBS. Pellet cellulare è stato risospeso in tampone di lisi alcalina [50 mM NaOH, pH 10.5, 2 mM EDTA, 1 mM fluoruro phenylmethylsulfonyl (PMSF), 2% SDS, 10% glicerolo, 5% 2-mercaptoetanolo e inibitori della proteasi (Roche Molecular Biochemicals)] bollire per 5 minuti, chiarificati mediante centrifugazione, e neutralizzato con 1 M HCl.
4. Proteine ​​da quantità equivalenti di lisato cellulare sono stati risolti su gel di poliacrilamide 8-16% SDS.

2. Per determinare il livello di espressione della proteina WRN sotto l'influenza di diverse concentrazioni di galattosio, le culture sono stati trattati come segue.

1. Trasformato sgs1 top3 ceppi sono stati coltivati ​​in SC raf meno Trp a 30 ° C per il pernottamento.
2. Culture erano reinoculated e incubate a 30 ° C fino alla fase di crescita precoce (diametro esterno ₆₀₀ di 0,5 - 0,8) e poi indotta con l'aggiunta di gal al 2% di concentrazione finale. Le culture sono stati poi permesso di crescere a 30 ° C per 6 h.
3. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e risospese in tampone (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, sodio desossicolato 1%, 1% Triton X-100, solfato di sodio 0,1% dodecil [SDS]) contenenti gli inibitori della proteasi (0,05% PMSF, 0,05 mcg / ml leupeptina).
4. Perle di vetro (425-600 micron) sono stati aggiunti alla miscela, e le cellule sono state rotte con il vortex.
5. L'omogenato ottenuto è stato centrifugato per 5 min a 15000 xg e la frazione surnatante è stato raccolto.
6. Proteine ​​nelle frazioni lisato è stato stimato con il metodo Bradford.
7. Concentrazione pari di proteine ​​da lisato diverse frazioni è stata risolta in gel di poliacrilammide 8-16% SDS.

3. Espressione di WRN o WRN proteine ​​mutanti è stato determinato mediante Western blot utilizzando un anticorpo monoclonale di topo WRN diretti contro un epitopo in un frammento C-terminale purificata di WRN [6] (1:1000, Spring Valley Labs).

4. Incubazione anticorpo primario è stata seguita da incubazione con una secondaria (rafano perossidasi-coniugato) anticorpi (1:5000). Macchine sono stati trattati con un sistema di rilevazione ECL Plus occidentale al protocollo del produttore.

5. Per l'analisi quantitativa Western Blot, aumentando le concentrazioni di ricombinanti purificate sono state incluse His-tagged full-length proteina WRN su gel in modo tale che alla quantificazione della macchia una curva lineare standard potrebbe essere generato. Inoltre, estratto dalla cellula quantità equivalente di cellule o 20 mg di lisato campioni del lievito sono stati caricati su gel per stimare la concentrazione di WRN.

6. ImageQuant analisi è stata poi eseguita su gel e standard di curva lineare è stata generata.

7. Concentrazione di proteina WRN a concentrazioni variabili gal è stato stimato utilizzando le normali curva lineare generato in precedenza.

8. Rappresentante Risultati

Tutti i ceppi utilizzati in questo studio sono auxotrophs Trp. Pertanto, sgs1, sgs1 top3 e wild-type W303-1A ceppi trasformati con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL-WRN sono stati selezionati sulla base della loro capacità di crescere in presenza di SC meno Trp media. Per esaminare l'effetto di espressione WRN sulla crescita del trasformato sgs1 top3 cellule mutanti, le culture erano striati su piastre contenenti SC meno Trp media con il 2% gal di indurre l'espressione WRN. Top3 decatenates intrecciate molecole di DNA generati dalla Sgs1 elicasi durante la replica [1, 2], quindi, in assenza di Top3, lo stress torsionale non è sollevato con conseguente crescita lenta e iper-ricombinazione. La funzione genetica della sgs1 è quella di sopprimere il fenotipo rallentare la crescita di un mutante top3. Se WRN potrebbe sostituire SGS1 in interazione genetica con Top3, restauro di top3 fenotipo crescita lenta in sgs1 top3 ci si aspetterebbe.

Come mostrato nella Figura 2A, il WRN trasformato sgs1 top3 ceppo è cresciuto molto più lentamente rispetto al vettore trasformato sgs1 top3 ceppo. Sgs1 top3 trasformato con il YEp112SpGAL-SGS1 plasmide è stato incluso come controllo positivo (Figura 2A), a dimostrazione che wild-type Sgs1 espresso nella top3 sgs1 mutante è riuscito a completare geneticamente il fenotipo crescita. La trasformata sgs1 top3 ceppi cresciuti allo stesso modo in assenza di una ragazza, come indicato per 2 giorni (Figura 2A). Espressione di WRN avuto alcun effetto sulla crescita di ceppi parentali wild-type (W3031A) o sgs1 (Figura 2B), indicando che l'effetto di WRN sulla crescita delle cellule era specifico a quella osservata nella top3 sgs1 sfondo mutante. Studi genetici eseguiti utilizzando varianti WRN dimostrato che WRN elicasi, ma non l'attività exonuclease era necessaria per il restauro della top3 fenotipo crescita (Figura 3B). Un polimorfismo missense naturalmente nel WRN che interferisce con l'attività elicasi abolita la sua capacità di ripristinare top3 fenotipo lenta crescita.

top3 ceppi mutanti sono in ritardo nella fase S/G2 tardiva del ciclo cellulare [1], una caratteristica che può spiegare la loro crescita lenta. Mutazione del gene SGS1 sullo sfondo top3 sopprime il ritardo nella fase S/G2 del ciclo cellulare. Se l'espressione WRN potrebbe ripristinare il ritardo nella fase S/G2 del ciclo cellulare in sgs1 top3, una popolazione elevata di grandi cellule sbocciato con nuclei indivisa ci si aspetterebbe per sgs1 top3 cellule mutanti che esprimono WRN. Come mostrato nella Figura 4, la percentuale di grandi cellule sbocciato era più alta per sgs1 top3 / WRN di sgs1 top3 / vettore, suggerendo il restauro del de S/G2 laici caratteristica della top3.

La top3 sgs1 doppio mutante è meno sensibile a un MMS o HU rispetto alla top3 singolo mutante [2]. Dal momento che la crescita delle cellule colpite WRN di sgs1 top3, abbiamo poi esaminato i suoi effetti sulla sensibilità al sulfonato methylmethane (MMS, un agente alchilante) e idrossiurea (HU, un inibitore della replicazione). Sgs1 top3 / WRN sensibilità visualizzata sia per i farmaci paragonabili a sgs1 top3 / SGS1 (Figura 5). L'analisi genetica delle varianti WRN rivelato che WRN elicasi / ATPasi, ma non l'attività esonucleasi WRN, è stato richiesto per il suo effetto sulla sensibilità a MMS e HU.

Figura 1. Presentazione schematica per la clonazione WRN / WRN varianti in formato vettoriale YEp112SpGAL. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 1.

Figura 2. WRN espressione in sgs1 top3 ripristina il fenotipo rallentare la crescita della top3. Pannello A, sgs1 top3 ceppo trasformato con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL WRN erano striati su un SC-Trp piastra contenente 2% glu o 2% gal. Come controllo sgs1 top3 ceppo trasformato con YEp112SpGAL SGS1 era striato da entrambe le piastre. Piastre sono state incubate a 30 ° C per 2 giorni e poi fotografato. Pannello B, ceppo di tipo selvatico genitori W303-1A o ceppo sgs1 trasformato con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL WRN erano striati su un SC-Trp piastra o contenenti 2% o del 2% glu gal . Piastre sono state incubate a 30 ° C per 4 giorni e poi fotografato. Composizione delle lastre era come nel Pannello di A e B del pannello, rispettivamente. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

Figura 3. WRN ATPasi / elicasi, ma non l'attività esonucleasi, è necessario per ripristinare il fenotipo lenta crescita della top3 in sgs1 top3 sfondo. Sgs1 top3 ceppo trasformato con ATPasi / elicasi-morto (YEp195SpGAL WRN K577M), esonucleasi-morti (YEp195SpGAL- WRN E84A), RQC mutante (YEp195SpGAL-WRN K1016A), o polimorfici mutante (YEp195SpGAL-WRN R834C) era striato su SC-Trp piastre contenente 2% glu (pannello C) o 2% gal (pannello B). Piastre sono state incubate a 30 ° C per 2 giorni e poi fotografato. Composizione delle lastre era come nel Pannello di A. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 3.

Figura 4. WRN espressione induce S/G2 arresto in sgs1 top3 cellule. Esponenzialmente crescente di culture sgs1 top3 ceppo trasformato con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, o YEp112SpGAL SGS1, e il vettore-trasformata wild-type di genitori sono stati indotti ad una concentrazione gal 2% per 6 h. Le culture sono state raccolte, elaborate per la colorazione DAPI come descritto in Materiali e Metodi e sono stati osservati con microscopio Axiovert 200 M (Zeiss, lente 100x). Indicata è la colorazione DAPI della top3 sgs1 trasformato con YEp112SpGAL (in alto a sinistra) e con YEp112SpGAL WRN (in alto a destra). Le frecce indicano le cellule con nuclei indivisa. Distribuzione delle cellule in G1 (singole cellule) e S/G2 (cellule germogliato) è mostrato in basso del pannello. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 4.

Figura 5. Effetto di espressione WRN sulla sensibilità MMS e HU di sgs1 top3 ceppo. Logaritmicamente crescente di culture sgs1 top3 ceppo trasformato con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, esonucleasi-morto (YEp112SpGAL-WRN E84A), ATPasi / elicasi-morto (YEp112SpGAL WRN K577M), RQC mutante (YEp112SpGAL-WRN K1016A), polimorfici mutante (YEp112SpGAL-WRN R834C), YEp112SpGAL SGS1 e vettore trasformato ceppi wild-type dei genitori sono stati visti in un diluizioni seriali di dieci volte in SC-Trp piastre contenenti glu o ragazza e sia MMS o HU alle concentrazioni indicate. Piastre sono state incubate a 30 ° C per 2 giorni (placche di comando) e 4 giorni (MMS e piastre HU) e poi fotografato. Per favore9/1639fig5.jpg "> clicca qui per vedere una versione più grande di figura 5.

Discussion

Uno dei punti di forza di usare lievito come sistema modello è la disponibilità di mutanti nella replicazione del DNA definiti e meccanismi di riparazione che si conservano tra il lievito e gli esseri umani. Ulteriore selezione dei trasformanti ospitare i geni specifici è facile e affidabile come i ceppi mutanti di laboratorio sono auxotrophic e vettori con marcatori auxotrophic sono facilmente disponibili. L'utilizzo di questi vettori l'espressione di prodotti genici possono essere regolati ponendoli sotto il controllo di un promotore inducibile (ad esempio, promotore inducibile gal, ecc.) Considerando questi vantaggi, abbiamo sviluppato un sistema basato su modello di lievito per studiare le esigenze funzionali del gene WRN umano difettoso nella sindrome di Werner in un percorso che è potenzialmente conservato tra uomo e lievito. Utilizzando gli approcci descritti, abbiamo fornito la prima evidenza che WRN può funzionare in un percorso genetica che colpisce top3 fenotipi correlati. Le nostre osservazioni richiesta di ulteriori indagini della possibilità che WRN interagisce funzionalmente con Top3α nelle cellule umane durante la replicazione del DNA cellulare o ricombinazione. Probabilmente, in un BLM-compromessa condizione, WRN può sostituire in parte per BLM attraverso la sua partnership con una proteina topoisomerasi.