Summary
שדה חשמלי חיצוני משרה מתח על הממברנה של התא, כינה את מתח קרום מושרה (ΔΦ). באמצעות צבע פוטנציומטרית di-8-ANEPPS, אפשר למדוד את ΔΦ noninvasively. וידאו זה מציג את הפרוטוקול למדידת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS.
Abstract
המיקום של תא לתוך שדה חשמלי חיצוני גורם אחראי המקומית חלוקה מחדש בתוך ומחוץ של התא בקרבת קרום התא, וכתוצאה מכך מתח על פני הממברנה. מתח זה, כינה את מתח קרום מושרה (מתח הטרנסממברני המושרה גם, או הבדל המושרה פוטנציאל הטרנסממברני) ו כונה על ידי ΔΦ, קיים רק כל עוד את השדה החיצוני הוא ההווה. אם מתח המנוחה נמצא על הממברנה, את המתח המושרה כופה (מוסיף) על זה. באמצעות אחד פוטנציומטרית צבעי ניאון, כגון di-8-ANEPPS, ניתן לצפות וריאציות של ΔΦ על קרום התא כדי למדוד את ערכו noninvasively. di-8-ANEPPS הופך ניאון חזק כאשר חייב bilayer השומנים של קרום התא, עם השינוי בעוצמת הקרינה ביחס לשינוי של ΔΦ. וידאו זה מציג את הפרוטוקול למדידת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS וגם מדגים את ההשפעה של צורת התא על המשרעת ואת הפריסה המרחבית של ΔΦ.
Protocol
חלק א: צעדים ראשונים
- בניסוי זה סינית התא אוגר השחלה שורה (CHO-K1) משמש. תאים הם מצופה במעבדה-Tek II לתאי (2 בארות, 4 ס"מ 2 כל אחד) (Nalge Nunc, גרמניה) ב ~ 0.7x10 5 תאים / מ"ל במדיום HAM-F12 תרבות בתוספת 8% עוברית עגל בסרום, 0.15 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין, 16 מ"ג / מ"ל גנטמיצין (כולם סיגמא אולדריץ, שטיינהיים, גרמניה), ו - 200 יחידות / מ"ל Crystacillin (Pliva, זאגרב, קרואטיה), ו מודגרות ב 5% CO 2 ב 37 ° C. לחלופין, תאים יכולים גם להיות מצופה על # 1 מכסה מחליק זכוכית (0.13-0.16 מ"מ עובי), מצופה דבק הסלולר כגון polylysine.
- דגירה התאים בינוני התרבות שלהם. הדגירה שנמשך 2-4 שעות התשואות תאים שעדיין כדורית בקירוב, אך מחובר היטב אל פני השטח עם חלק קטן של הממברנה שלהם. לחלופין, לאחר 16 עד 20 שעות של דגירה, תאים מחוברים באופן מלא על פני השטח ויש להם צורות מורכבות יותר, אבל רובם עדיין אינם מתחלקים.
- הכן 10 מ"מ מניות פתרון של di-8-ANEPPS (Invitrogen, יוג'ין, אורגון, ארה"ב) על ידי הוספת 843 μl של DMSO (סיגמא אולדריץ, שטיינהיים, גרמניה) עד 5 מ"ג הצבע שעל הבקבוקון Invitrogen המקורי. הפתרון המניה ניתן לאחסן במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. לפני שמתחילים את הניסויים, לחמם את התמיסה עד גבישים של DMSO להתמוסס.
- כמה שורות תאים עשויים לדרוש את השימוש pluronic כדי להקל על שילוב צבע לתוך קרום התא. Pluronic ניתן לרכוש פתרון המניה 20% DMSO (F-127, Invitrogen, יוג'ין, אורגון, ארה"ב), או פתרון המניות של ריכוז אותו ניתן להכין על ידי המסת pluronic ב DMSO. פתרון במלאי של pluronic ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר.
חלק שני: טעינת תאים עם di-8-ANEPPS
- מערבבים 3 μl של 10 מ"מ di-8-ANEPPS ו 2.5 μl של pluronic 20% ב 1 מ"ל של השינוי ספינר (סידן מדולדל גרסה) של SMEM בינוני מינימום הכרחי (בינוני או M8167 M4767, סיגמא אולדריץ, שטיינהיים, גרמניה ) בתוך צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. זה מניב "פתרון טעינת" המכיל כ 30 מיקרומטר di-8-ANEPPS ו 0.05% pluronic. עבור סוגי תאים אחרים, התקשורת מולדתם התרבות יכול לשמש במקום SMEM.
- החלף את המדיום תרבות בחדר Lab-Tek עם פתרון הטעינה. העברה לתא למקרר 10 דקות ב 4 ° C. בטמפרטורה זו, הפנמה של הצבע דרך הממברנה פלזמה היא בעיקר עכבות.
- לאחר מכתים, לשטוף בעדינות את עודפי הצבע פעמיים עד שלוש פעמים עם SMEM טהור.
- עזוב 1.5 מ"ל של SMEM בחדר.
חלק שלישי: ניסוי רכישת תמונה
- התאים הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו Zeiss AxioVert 200, Zeiss, גרמניה) מצויד אובייקטיבי שמן טבילה (x63, NA 1.4), monochromator (צבעוני IV, Visitron, גרמניה) מקורר מצלמת CCD (VisiCam 1280, Visitron, גרמניה). התמונות הן רכשה עם MetaFluor 7.1.1 ומעובד MetaMorph 7.1.1 (שני התקנים מולקולריים, Downingtown, פנסילבניה, ארה"ב), אך רכישת תוכנה דומה אחרת יכול לשמש גם. קבע את אורך הגל עירור בתוכנה רכישת 490 ננומטר לבחור מסנן פליטה מתאים ANEPPS, למשל, מסנן הלהקה עוברים מרוכז ב 605 ננומטר (605/55m, dichroic 565 DCXR, Chroma, Rockingham, ורמונט, ארה"ב). אם monochromator אינו זמין, מסנן עירור מרוכז ב 490 ננומטר יכול לשמש במקום.
- מניחים את החדר עם תאים לבמה מיקרוסקופ, מיקום האלקטרודות בחלק התחתון של החדר ולחבר אותם מחולל את הדופק. המדיום צריך לכסות את האלקטרודות.
- כדי לשמור על כדאיות התא ולהפחית את החימום, הדופק צריך להיות של משרעת נמוכה מספיק זמן קצר. בניסוי זה דופק מרובע עם 35 V משרעת 50 ms המשך (נמוכה מספיק כדי למנוע electroporation) מופק באמצעות אספקת מתח DC ו מחוייט המיקרו שבשליטת מכשיר switcher. לחלופין, גנרטור הדופק מסחריים, כגון 33210A (Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב) מחוברים למגבר או ממריץ מסחריים, כגון S88 (גראס, West Warwick, RI, ארה"ב), ניתן להשתמש. הדופק מועבר לשני Pt / עיר אלקטרודות מקבילות חוט בקוטר 0.8 מ"מ ו 4 מ"מ המרחק ביניהם, יצירת שדה חשמלי של כ 88 V / ס"מ בין אלקטרודות ΔΦ גרימת. הפצה השדה המדויק בין האלקטרודות השתמשו בניסוי הזה מתואר במקומות אחרים [1].
- מצא את התאים של עניין. החל דופק חשמלי יחיד או רצף של פולסים. במשך הדופק בכל, לרכוש שתי תמונות פלואורסצנציה: אחת מיד לפני הדופק (התמונה שליטה), ואחד במהלך הדופק (דופק את התמונה). בשל ההיענות הנמוכה של di-8-ANEPPS, השינויים הקרינה קשה להבחין בעין בלתי מזוינת ולהפוך onl לכאורהy לאחר עיבוד. משלוח דופק חייב להיות מסונכרן עם רכישת תמונה, אשר היא תכונה של התוכנה הרכישה. כדי להימנע photobleaching ואפשרי חימום, תאורה יכול להיות מוגבל משך הדופק.
חלק ד ': עיבוד תמונה וניתוח
- פתח את התמונות בתוכנה MetaMorph. במשך הדופק כל, לחסר הרקע בשליטה והן את תמונת הדופק.
- בחר תא ולהגדיר את האזור עניין כל כך מתאים הממברנה. מדדו את עוצמות הקרינה לאורך האזור הזה בתמונה מלאה הדופק ולהעביר את הערכים לגיליון אלקטרוני.
- במשך הדופק בכל, מפחיתה את הנתונים לשלוט מהנתונים הדופק, ולחלק את התוצאה ב נתונים מלאה כדי לקבל את השינויים הקרינה היחסית. אם רצף של פולסים מוחל, ערכים של שינויים הקרינה היחסית שנקבע הדופק כל יכול להיות בממוצע כדי לקבל מדידה אמינה יותר.
- המרה השינויים הקרינה היחסית לתוך ΔΦ באמצעות עקומת כיול. הערכה גסה של עקומה זו ניתן לקבל מן הספרות, אבל דיוק גבוהה יותר, הוא צריך להימדד להתקנה ומקרה. עבור תאים ההתקנה השתמשו בניסוי זה ירידה של 6% הקרינה המתאים גידול של 100 mV ב ΔΦ [2].
- לבסוף, העלילה מתח כפונקציה של אורך קשת יחסית חבילת תוכנה גרפים כגון Excel (מיקרוסופט, ברדמונד, וושינגטון, ארה"ב), מגרש סיגמא (Systat Software Inc, בסן חוזה, קליפורניה, ארה"ב), או מקור (OriginLab קורפ, Northampton, מסצ'וסטס, ארה"ב). עקומת יכול גם להיות מוחלק באמצעות מסנן מתאים, כגון מסנן הממוצע הנע.
Discussion
מדידות של קרום המתח המושרה (הטרנסממברני), ΔΦ, יכול להיות חשוב במסגרות ניסיוניות שונות, כגון מחקרים של מתח מגודרת ערוצי הממברנה, התפשטות פוטנציאל פעולה, גירוי תא לב או קרום התא electroporation [3, 4, 5, 6 , 7]. עם צורות תאים פשוטים, ΔΦ ניתן לחשב אנליטית. לדוגמה, עבור תא כדורי, ΔΦ ניתנת על ידי המשוואה של והמתנות, אשר קובע כי מתח הוא יחסי כוח בשדה וגודל התא עוקב אחר פונקציה קוסינוס לאורך הממברנה [8, 9]. במשך יותר צורות תא מסובך, ΔΦ יכולים לסטות באופן משמעותי מן הקוסינוס ואת צריכה להיקבע גם מבחינה מספרית, באמצעות מחשב [2, 10, 11], או באופן ניסיוני, באמצעות צבע פוטנציומטרית [12, 13, 14, 15].
אחת צובעת פוטנציומטרית בשימוש נרחב למטרה זו היא די-8-ANEPPS (di-8-בוטיל-amino-naphthyl-אתילן-pyridinium-propyl-sulfonate), צבע מהיר עם עירור ופליטה ספקטרה תלוי מתח הממברנה, המאפשרת תצפיות פולשני של וריאציות של ΔΦ על קרום התא כדי למדוד את הערך שלו. בסרטון הזה, אנו מציגים גישה ניסויית לקביעת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS.
לצבוע פותחה על ידי פרופ 'לסלי לייב ועמיתיו [13, 14] באוניברסיטת קונטיקט משתייכת של מהיר בתגובה צבעים. di-8-ANEPPS הוא nonfluorescent במים הופך ניאון חזק כאשר היא משלבת לתוך bilayer השומנים של קרום התא. שינוי בתוצאות ΔΦ לשינוי חלוקת תשלום intramolecular ושינויים המקביל פרופיל העוצמה הספקטרלית של הקרינה של צבע. עוצמת הקרינה של di-8-ANEPPS משתנה באופן פרופורציונלי לשינוי של ΔΦ; את תגובת הצבע הוא ליניארי עבור מתח הנעים בין 250 ל -280 mV mV [4, 16]. שינויים קטנים יחסית הקרינה של כתמים, צבע קרום אחיד, והפנמה לצבוע את di-8-ANEPPS פחות מתאים למדידות המוחלט של מתח הממברנה, למשל, מרכיב המנוחה שלה, למרות מאמצים אלה דווחו גם [17]. היא, לעומת זאת, מתאים למדידת שינויים גדולים יותר מתח הממברנה, כגון תחילתו של מתח הקרום המושרה בתאים nonexcitable להיחשף לשדות חשמליים חיצוניים [12, 13], או פוטנציאל פעולה בתאי להתרגש [4, 5]. למרות שלא חל כאן, di-8-ANEPPS גם מאפשר קביעת ΔΦ על ידי מדידות ratiometric של עירור הקרינה [18] או פליטה [19], אשר מגביר את הרגישות של התגובה ומקטין את ההשפעות הנ"ל. כפי di-8-ANEPPS כתמים הממברנה, הוא יכול לשמש גם בבירור כסמן קרום [2].
אחד החסרונות של צבע היא כי הוא נוטה photobleaching, כך חשיפה ממושכת לאור חזק יש להימנע. כיול צבע מתבצע עם valinomycin (i) או ionophore אשלגן קבוצה של ריכוזי אשלגן שונות במדיום חיצוני [2,18], או (ii) תיקון-clamp במצב מהדק מתח [17].
לבסוף, עם מדידות של ΔΦ על תאים כדוריים תאים של צורות מורכבות יותר, הווידאו מדגים את ההשפעה של צורת התא על חלוקת משרעת המרחבי של ΔΦ. לכן עבור תאים כדוריים ΔΦ קרוב קוסינוס, בהסכמה עם המשוואה של והמתנות, ואילו תא מורכב יותר צורות הפריסה המרחבית של ΔΦ הוא מורכב יותר [20] ...
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר סלובנית עם הפרויקט Z2-9229 תוכנית P2-0249. וידאו זה מייצג את חומר משלים עבור "electroporation מבוססי טכנולוגיות וטיפולים" סדנה מדעית קורס אקדמי, מאורגן פעמיים בשנה באוניברסיטת לובליאנה, סלובניה על ידי הפקולטה להנדסת חשמל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. Electropermeabilization of cell membranes. Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).
- Sersa, G., Miklavčič, D. Electrochemotherapy of tumours. JoVE. 22, (2008).
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
