Summary
외부 전기장은 세포의 막에 전압을 유도, 유도 멤브레인 전압 (ΔΦ) 칭했다. potentiometric 염색 DI - 8 - ANEPPS을 사용하여, 그것은 noninvasively ΔΦ를 측정할 수 있습니다. 이 비디오는 측정을위한 프로토콜을 보여줍니다 ΔΦ DI - 8 - ANEPPS를 사용합니다.
Abstract
외부 전기장에 세포의 위치는 세포막에 걸쳐 전압 그 결과, 지역 요금 재배포 내부와 세포막의 주변에있는 세포의 외부를 일으 킵니다. 이 전압은 유도 멤브레인 전압을 칭했다 (또한 유도 transmembrane 전압 또는 유도 transmembrane 잠재력의 차이)와 ΔΦ으로 표시, 오직 외부 필드가 존재하는만큼 존재한다. 휴식 전압 막에 존재하면, 유도 전압이에 (추가) superimposes. 이러한 DI - 8 - ANEPPS로 potentiometric 형광 염료, 중 하나를 사용하여, 그것은 세포막에 ΔΦ의 변화를 관찰하고 noninvasively의 가치를 측정하는 것이 가능합니다. ΔΦ의 변화에 비례 형광 강도의 변화와 세포막의 지질 이중층에 바인딩된 경우 DI - 8 - ANEPPS 강력히 형광됩니다. 이 비디오는 측정을위한 프로토콜 ΔΦ DI - 8 - ANEPPS를 사용을 보여줍니다 또한 진폭과 ΔΦ의 공간적 분포에서 셀 모양의 영향을 보여줍니다.
Protocol
부 I : 예비 단계
- 본 실험 중국 햄스터 난소 세포 라인 (CHO - K1)이 사용됩니다. 세포 8% 소태아 혈청 보충 햄 - F12 문화 매체 ~ 0.7x10 5 셀 / ML, 0.15 MG / ML에 실험실 - 테크 II 챔버 (2 우물, 4cm 2 각) (Nalge Nunc, 독일)에 비쳐지게 만들려합니다 L - 글루타민, 16 MG / ML gentamicin (시그마 - 알드리치, Steinheim, 독일에서), 200 단위 / ML Crystacillin (Pliva, 자그레브, 크로아티아), 그리고 37 5 % CO 2에서 incubated ° C. 또는 세포는 또한 polylysine 같은 휴대폰 접착제와 코팅 # 1 유리 커버 풀렸는데 (두께는 0.13-0.16 ㎜)에 도금 수 있습니다.
- 그들의 문화 매체에있는 세포를 품어. 여전히 약 구형 있지만, 단호하게 자신의 막의 작은 부분으로 표면에 부착된 2-4시간의 수율 세포를 지속 인큐베이션. 또는 부화 16~20시간 후 세포가 완전히 표면에 붙어 더 복잡한 모양을 가지고 있지만, 대부분은 여전히 분리되지 않습니다됩니다.
- 원본 Invitrogen의 약병에 든 색소 5 밀리그램 DMSO의 843 μl (시그마 - 알드리치, Steinheim, 독일)를 추가하여 DI - 8 - ANEPPS (Invitrogen, 유진, 오레곤, 미국)의 10 MM 주식 솔루션을 준비합니다. 주식 솔루션은 몇 개월 4 ° C에서 냉장고에 저장할 수 있습니다. DMSO의 크리스탈 녹이신 때까지 실험을 시작하기 전에, 솔루션을 따뜻하게.
- 일부 세포 라인은 세포막에 염료 설립을 쉽게하기 pluronic의 사용이 필요할 수 있습니다. Pluronic는 20 % DMSO (F - 127, Invitrogen, 유진, 오레곤, 미국)의 주식 솔루션 또는 DMSO에 pluronic을 용해하여 준비할 수 같은 농도의 주식 솔루션에 구입하실 수 있습니다. pluronic 재고 솔루션은 상온에서 저장할 수 있습니다.
부 II : DI - 8 - ANEPPS으로 세포 중
- 10 MM DI - 8 - ANEPPS 및 최소 필수 매체 SMEM의 스피너 수정 1 ML (칼슘 고갈 버전) (중간 M8167이나 M4767, 시그마 - 알드리치, Steinheim, 독일 20 % pluronic 2.5 μl 3 μl를 혼합 1.5 ML Eppendorf 튜브에). 이것은 약 30 μm의 DI - 8 - ANEPPS 및 pluronic의 0.05 %를 포함하는 "로딩 솔루션"을 산출. 다른 세포 유형에 대한 그들의 고유 문화 미디어는 대신 SMEM에 사용할 수 있습니다.
- 로딩 솔루션 연구소 - 테크 챔버에있는 문화 매체를 교체합니다. 4 10 분 냉장고에 챔버를 전송 ° C. 이 온도에서 플라즈마 막 통해 염료의 국제화가 크게 저해합니다.
- 얼룩 후, 부드럽게 순수 SMEM와 함께 여분의 염료를 두 세번을 씻는다.
- 챔버에 SMEM 1.5 ML를 남겨주세요.
파트 III : 실험 및 이미지 수집
- 세포는 기름 침지 목표 (x63, NA 1.4), 단색 (폴리 크롬 IV, Visitron, 독일) 및 냉각 CCD 카메라 (VisiCam 장착된 형광 현미경 (우리의 경우에는 자이스 혈구 AxioVert 200 자이스 혈구, 독일)를 사용하여 관찰 1280, Visitron, 독일). 이미지 MetaFluor 7.1.1로 인수하고 (두 분자 디바이스, 다우닝, PA, 미국) MetaMorph 7.1.1로 처리하지만, 다른 유사한 수집 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. 490 nm의에 인수 소프트웨어의 여기 파장을 설정하고 예를 들어 ANEPPS에 적합한 배출 필터, 605의 nm의 중심 대역 통과 필터를 (605/55m, 이색성 565 DCXR, 채도, 로킹엄, VT, 미국)를 선택합니다. 단색를 사용할 수없는 경우, 490 nm의 중심 여기 필터를 대신 사용할 수 있습니다.
- 현미경 단계에 세포와 챔버를 놓고, 챔버의 하단에있는 전극을 위치와 펄스 발생기에 연결합니다. 매체는 전극을 커버한다.
- 세포 생존을 유지하고 가열을 줄이기 위해 뛰고있는 충분히 낮은 진폭과 짧은 기간합니다. 본 실험에서는 35 V 진폭 50 MS 기간 (electroporation를 피할 정도로 낮은)과 사각형 펄스는 DC 전압 공급 장치 및 사용자 정의 - 만든 마이크로 프로세서 제어 교환기 장치를 사용하여 생성됩니다. 또는 이러한 33210A (애질런트, 산타 클라라, CA, 미국)와 같은 상업 펄스 발생기는 증폭기 또는 S88 (그라스, 웨스트 워릭, RI, 미국)와 같은 상업 자극기에 연결, 사용할 수 있습니다. 펄스는 전극과 유도 ΔΦ 사이에 약 88 V / cm의 전기장을 만들고, 0.8 mm의 직경과 그들 사이 4mm 거리 두 개의 병렬 PT / IR 와이어 전극에 전달됩니다. 본 실험에 사용되는 전극 사이의 정확한 필드 분포가 다른 [1] 설명되어 있습니다.
- 관심의 세포를 찾습니다. 하나의 전기 펄스 또는 펄스의 시퀀스를 적용합니다. 즉시 펄스 (관리 이미지) 전에, 그리고 펄스 (펄스 이미지) 동안 하나의 각 펄스에 대한 두 개의 형광 이미지를 획득. DI - 8 - ANEPPS의 낮은 반응으로 인해, 형광의 변화는 육안으로 분별하고 명백한 onl 될 어렵습니다처리 후 Y. 펄스 전송은 수집 소프트웨어의 기능 이미지 수집과 동기화해야합니다. 난방 photobleaching 가능한 피하려면, 조명은 펄스의 기간을 제한할 수 있습니다.
파트 IV : 이미지 처리 및 분석
- MetaMorph 소프트웨어에서 이미지를 엽니다. 각 펄스 들어, 컨트롤 및 펄스 이미지 모두에서 배경을 뺍니다.
- 셀을 선택하고 그것이 막에 해당되도록 관심 영역을 설정합니다. 제어 및 펄스 이미지를이 지역에 따라 형광 강도를 측정하고 스프레드 시트에 값을 전송합니다.
- 각 펄스의 경우 펄스 데이터 컨트롤 데이터를 빼야하고, 상대 형광 변화를 얻기 위해 제어 데이터에 의해 결과를 나눕니다. 펄스의 시퀀스가 적용되면, 각 펄스에 대한 결정 상대적으로 형광 변화의 값이보다 신뢰할 수있는 측정을 얻으려면 평균 수 있습니다.
- 교정 곡선을 사용하여 ΔΦ에 상대적인 형광 변화를 변환. 이 곡선의 대략 견적은 문학에서 얻은지만, 높은 정확성, 그것은 각각의 특정 설치에 대해 측정되어야 수 있습니다. 세포가이 실험에서 사용되는 설정을위한 형광의 6 % 감소 ΔΦ [2]에 100 MV 증가에 해당합니다.
- 마지막으로, 이러한 엑셀 (마이크로 소프트, 레드 몬드, WA, 미국), 시그마 플롯 (Systat 소프트웨어 주식 회사, 산호세, CA, 미국)와 같은 그래프 소프트웨어 패키지에 상대 아크 길이의 함수로 전압을 계획하거나, 원산지 (OriginLab 공단, 노샘프턴, MA, 미국). 곡선은 또한 이동 평균 필터로 적합한 필터를 사용하여 smoothed 수 있습니다.
Discussion
유도 멤브레인 (transmembrane) 전압, ΔΦ의 측정은 전압 - 게이 티드 멤브레인 채널, 액션 잠재적인 전파, 심장 세포 자극, 또는 세포막의 electroporation [3, 4, 5, 6, 연구 등 다양한 실험 설정에 중요한 수 , 7]. 간단한 세포 형태로 ΔΦ analytically 계산하실 수 있습니다. 예를 들어, 구형 세포에 대한, ΔΦ은 전압이 필드 강도와 셀 크기에 비례되는 상태와 멤브레인 따라 코사인 함수를 다음과 슈완의 방정식에 의해 주어집니다 [8, 9]. 더 복잡한 세포 모양의 경우, ΔΦ 코사인에서 상당히 이탈하고 potentiometric 염료 [12, 13, 14, 15]을 사용하여, [2, 10, 11], 또는 실험적으로 컴퓨터를 사용하거나 숫자 결정되어야합니다.
널리 이러한 목적에 사용되는 potentiometric 염료 중 하나는 DI - 8 - ANEPPS (DI - 8 - 부틸 - 아미노 naphthyl - - pyridinium - 프로필 - 산염 에틸렌), 여기 및 발광의 막 전압에 의존 스펙트럼과 빠른 염료입니다 이것은 세포막과 그 가치를 측정하는 ΔΦ의 변형의 비침 투 관찰 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 디 - 8 - ANEPPS을 사용하여 ΔΦ 결정을위한 실험 방법을 보여줍니다.
염료는 코네티컷 대학의 교수 레슬리 로우 및 동료 [13, 14]에 의해 개발하고 빠르게 반응 염료의 클래스에 속하는했다. DI - 8 - ANEPPS은 물에 nonfluorescent이며 이것은 세포막의 지질 이중층에 통합하면 강력하게 형광됩니다. 분자내 전하 분포와 염료의 형광 스펙트럼의 프로필과 강도에 해당 변경 사항 변경 ΔΦ 결과에서 변경할 수 있습니다. DI - 8 - ANEPPS의 형광 강도는 ΔΦ의 변화에 비례 다양하며 염료의 반응은 -280 뮤직 비디오에서 250에 이르기까지 다양한 뮤직 비디오 [4, 16] 전압에 대한 선형이다. 이러한 노력도 [17]을보고 있었지만 염료, 고르지 멤브레인 얼룩의 형광 상대적으로 작은 변화, 그리고 염료 국제화는 멤브레인 전압, 예를 들어 자사의 휴식 구성 요소의 절대 측정을위한 DI - 8 - ANEPPS 덜 적합합니다. 그것은, 그러나, 고르기 세포 [4, 5]에 외부 전기 분야에 노출 nonexcitable 세포에서 유도된 막 전압의 발병 [12, 13], 또는 행동 잠재력으로 막 전압에 큰 변화를 측정에 적합합니다. 여기에 적용되지 않지만, DI - 8 - ANEPPS도 있습니다 형광 여기의 ratiometric 측정하여 ΔΦ 결정 [18] 또는 방출 반응의 감도를 증가하고 상기 효과를 감소 [19]. DI - 8 - ANEPPS 얼룩에 막을로서, 그것은 또한 멤브레인 마커로 노골적으로 사용할 수있는 [2].
염색의 단점 중 하나는 photobleaching하는 경향이있다이다, 그래서 강한 빛에 장시간 노출을 피해야한다고. 염료의 보정이 외부 매체 중 (I) 칼륨 ionophore의 valinomycin과 다른 칼륨 농도의 집합으로 수행 [2,18], 또는 (ii) 패치 - 클램프 전압 클램프 모드에서 [17].
마지막으로, 구형 세포와 더 복잡한 형태의 세포에 ΔΦ의 측정, 비디오 ΔΦ의 진폭 및 공간적 분포에 세포 형태의 영향을 보여줍니다. 따라서 구형 세포에 대한 ΔΦ 더 복잡한 세포 형태에 대한 ΔΦ의 공간적 분포가 더 복잡한 반면, 슈완의 방정식과 합의에 코사인 인접해 있습니다 [20] ...
Acknowledgments
이 작품은 프로젝트 Z2 - 9229 및 프로그램 P2 - 0249와 슬로베니아어 연구 기관에 의해 지원되었다. 이 비디오는 "Electroporation 기반 기술 및 트리 트먼트"류블랴나 대학, 슬로베니아에서 전기 공학부에 의해 biannually 조직 과학 워크샵 및 대학원 과정에 대한 보충 자료를 나타냅니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
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