Summary
Extern elektriskt fält inducerar en spänning på membranet i en cell kallas inducerad membranet spänning (ΔΦ). Genom att använda potentiometrisk dye di-8-ANEPPS, är det möjligt att mäta ΔΦ noninvasivt. Denna video visar protokoll för mätning ΔΦ med di-8-ANEPPS.
Abstract
Placering av en cell i ett yttre elektriskt fält orsakar en lokal inne i avgift omfördelning och utanför cellen i närheten av cellmembranet, vilket resulterar i en spänning över membranet. Denna spänning kallas inducerad membranet spänning (även inducerad transmembrana spänning, eller inducerad transmembrana potentialskillnad) och betecknas med ΔΦ existerar bara så länge som det yttre fältet är närvarande. Om den vilande spänningen är närvarande på membranet, överlagrar den inducerade spänningen (lägger till) på den. Genom att använda en av de potentiometrisk fluorescerande färger, såsom di-8-ANEPPS är det möjligt att observera varianter av ΔΦ på cellmembranet och att mäta dess värde noninvasivt. di-8-ANEPPS blir starkt fluorescerande när bundet till membranet av cellmembranet, med byte av fluorescensintensiteten proportionell mot förändringen av ΔΦ. Denna video visar protokoll för mätning ΔΦ med di-8-ANEPPS och visar påverkan av cellens form på amplitud och geografiska fördelningen av ΔΦ.
Protocol
Del I: Förberedande åtgärder
- I detta experiment kinesisk hamster cellinje (CHO-K1) används. Celler är pläterade i Lab-Tek II kammare (2 brunnar, 4 cm 2 vardera) (Nalge Nunc, Tyskland) vid ~ 0.7x10 5 celler / ml i HAM-F12 odlingsmedium kompletteras med 8% fetalt kalvserum, 0,15 mg / ml L-glutamin, 16 mg / ml gentamicin (alla från Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland), och 200 enheter / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Kroatien), och inkuberas i 5% CO 2 vid 37 ° C. Alternativt kan cellerna även pläterade på # 1 halk skyddsglaset (från 0,13 till 0,16 mm tjock), överdragen med en cellulär lim som polylysine.
- Inkubera cellerna i odlingsmedium. Inkubation varar 2 till 4 timmar ger celler som fortfarande är ungefär sfäriska, men bestämt fastnat på ytan med en liten del av deras membran. Alternativt efter 16 till 20 timmar inkubation celler helt knutna till ytan och har mer komplexa former, men de flesta av dem är fortfarande inte dela.
- Förbered en 10 lösning mM lager av di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) genom att tillsätta 843 l av DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) till 5 mg av färgen i den ursprungliga Invitrogen flaskan. Beståndet lösning kan förvaras i kylskåp vid 4 ° C under flera månader. Innan experimenten, värma upp lösningen tills kristaller av DMSO löses.
- Vissa cellinjer kan kräva användning av pluronic att lindra färgämnet införlivas i cellmembranet. Pluronic kan köpas i 20% stamlösning i DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), eller en stamlösning av samma koncentration kan beredas genom upplösning pluronic i DMSO. Stamlösning av pluronic kan förvaras i rumstemperatur.
Del II: Fylla celler med di-8-ANEPPS
- Blanda 3 l 10 mm di-8-ANEPPS och 2,5 l 20% pluronic i 1 ml av Spinner modifiering (kalcium utarmat version) av Minimum Essential Medium SMEM (medium M8167 eller M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland ) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Detta ger en "loading lösning" innehållande ca 30 mikroM di-8-ANEPPS och 0,05% av pluronic. För andra celltyper kan deras modersmål odlingssubstrat användas i stället för SMEM.
- Byt odlingsmedium i Lab-Tek kammare med lastning lösningen. Överför kammaren till kylskåpet i 10 min vid 4 ° C. Vid denna temperatur är internalisering av färgen genom plasmamembranet stor del hämmas.
- Efter färgning försiktigt tvätta överskottsfärg två till tre gånger med ren SMEM.
- Lämna 1,5 ml SMEM i kammaren.
Del III: Experimentera och bild förvärv
- Cellerna observeras med hjälp av en fluorescensmikroskop (i vårt fall Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Tyskland) utrustad med en oljeimmersion mål (x63, NA 1,4), en monokromator (polykrom IV, Visitron, Tyskland) och en kyld CCD-kamera (VisiCam 1280, Visitron, Tyskland). Bilderna förvärvas med MetaFluor 7.1.1 och bearbetas i metamorfa 7.1.1 (både molekylära enheter, Downingtown, PA, USA), men andra liknande förvärv programvara kan också användas. Ställ excitationsvåglängden i förvärvet programvara till 490 nm och välja en lämplig utsläpp filter för ANEPPS, till exempel ett bandpassfilter centrerad vid 605 nm (605/55m, dikroiskt 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, USA). Om en monokromator inte är tillgänglig, kan en excitation filter centrerade vid 490 nm användas i stället.
- Placera kammaren med celler på mikroskop scenen, placera elektroderna i botten av kammaren och ansluta dem till pulsgeneratorn. Mediet bör omfatta elektroderna.
- För att upprätthålla cellernas livskraft och minska uppvärmning, bör pulsen vara tillräckligt låg amplitud och kort varaktighet. I detta experiment en fyrkantig puls med 35 V amplitud och 50 ms duration (tillräckligt låg för att undvika elektroporation) genereras med hjälp av en DC-spänningsmatning och en skräddarsydd mikroprocessorstyrd switcher enhet. Alternativt kan en kommersiell puls generator, såsom 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) kopplad till en förstärkare eller en kommersiell stimulator, som S88 (Grass, West Warwick, RI, USA), kan användas. Pulsen levereras till två parallella Pt / Ir tråd elektroder med 0,8 mm diameter och 4 mm avstånd mellan dem och skapa ett elektriskt fält på ca 88 V / cm mellan elektroderna och förmå ΔΦ. Den exakta fältet fördelningen mellan elektroderna används i detta experiment beskrivs på annat håll [1].
- Hitta cellerna av intresse. Applicera en elektrisk puls eller en sekvens av pulser. För varje puls förvärvar två fluorescens bilder: ett omedelbart före pulsen (kontroll bilden), och en under pulsen (puls bild). På grund av den låga svar av di-8-ANEPPS, förändringar i fluorescens är svåra att urskilja med blotta ögat och bli uppenbara only efter bearbetning. Pulsen leveransen måste synkroniseras med bilden förvärvet, som är en funktion av förvärvet programvara. För att undvika fotoblekning och eventuell uppvärmning kan belysningen vara begränsad till den tid pulsen.
Del IV: Bildbehandling och analys
- Öppna bilderna i metamorfa programvara. För varje puls, subtrahera bakgrund i både kontrollen och pulsen bilden.
- Välj en cell och sätta regionen av intresse så att det svarar mot membranet. Mät fluorescensen intensiteter längs denna region i kontrollen och puls bild och överföra värdena till ett kalkylblad.
- För varje puls, subtrahera kontrollen data från puls data, och dividera resultatet med kontrolldata för att få den relativa fluorescens förändringar. Om en sekvens av pulser tillämpas, kan värdena för relativ fluorescens förändringar fastställs för varje puls beräknas som medelvärde för att få en mer tillförlitlig mätning.
- Omvandla den relativa fluorescensen ändras till ΔΦ med hjälp av en kalibreringskurva. En grov uppskattning av denna kurva kan fås från litteraturen, men för högre noggrannhet, måste det mäts för varje enskild installation. För celler och inställningar som används i detta experiment en 6% minskning av fluorescens motsvarar en 100 mV ökning ΔΦ [2].
- Slutligen, tomt spänningen som en funktion av den relativa båglängd på en grafritande mjukvarupaket som Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA), eller Ursprung (OriginLab Corp, Northampton, MA, USA). Kurvan kan också jämnas med ett lämpligt filter, såsom glidande medelvärde.
Discussion
Mätningar av inducerad membranet (transmembrana) spänning, ΔΦ, kan vara viktiga i olika experimentella inställningar, t ex studier av spänningskänsliga membran kanaler, aktionspotential förökning, hjärt-cell stimulering eller cellmembran elektroporation [3, 4, 5, 6 , 7]. Med enkla cellen former kan ΔΦ beräknas analytiskt. Till exempel för en sfärisk cell är ΔΦ ges av Schwan s ekvation som säger att spänningen är proportionell mot fältstyrkan och cellstorlek och följer cosinus funktion längs membranet [8, 9]. För mer komplicerade cell former kan ΔΦ avvika avsevärt från cosinus och måste bestämmas antingen numeriskt med hjälp av en dator [2, 10, 11], eller experimentellt, med hjälp av en potentiometrisk färgämne [12, 13, 14, 15].
En av de potentiometrisk färgämnen allmänt används för detta ändamål är di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naphthyl-etylen-pyridintvärbindningar-propyl-sulfonat), en snabb färg med excitation och emissionsspektra beroende på membranet spänning, som möjliggör noninvasiv observationer av variationer av ΔΦ på cellmembranet och att mäta dess värde. I denna video visar vi en experimentell metod för bestämning av ΔΦ genom att använda di-8-ANEPPS.
Färgen har utvecklats av professor Leslie Loew och medarbetare [13, 14] vid University of Connecticut och tillhör den klass av snabba respons färgämnen. di-8-ANEPPS är nonfluorescent i vatten och blir starkt fluorescerande när den införlivas i membranet av cellmembranet. En förändring av ΔΦ resulterar i en förändring av intramolekylära avgiften distribution och motsvarande ändringar i den spektrala profil och intensiteten i färgen s fluorescens. Fluorescensintensiteten av di-8-ANEPPS varierar proportionellt med förändringen av ΔΦ, svaret av färgen är linjär för spänningar mellan -280 mV till 250 mV [4, 16]. Relativt små förändringar i fluorescens av färgen, ojämn membranfärgning, och färgämnet internalisering gör di-8-ANEPPS mindre lämplig för absolut mätning av membran spänning, t.ex. dess vila komponent, även om sådana insatser har också rapporterats [17]. Det är dock lämplig för mätning av större förändringar i membranet spänning, såsom uppkomsten av inducerad membranet spänning i nonexcitable celler som utsätts för yttre elektriska fält [12, 13], eller potentialer åtgärder retbara celler [4, 5]. Även om det inte tillämpas här, gör di-8-ANEPPS också bestämning av ΔΦ genom ratiometrisk mätningar av fluorescens excitation [18] eller utsläpp [19], vilket ökar känsligheten av svaret och minskar de ovan nämnda effekter. Som di-8-ANEPPS fläckar membranet, kan den också användas tydligt som ett membran markör [2].
En av nackdelarna med färgen är att den är benägen att fotoblekning, så att långvarig exponering för starkt ljus bör undvikas. Kalibrering av färgen görs med antingen (i) kalium jonofor valinomycin och en uppsättning av olika kalium koncentrationer i externt medium [2,18], eller (ii) patch-clamp i spänning klämma läge [17].
Slutligen, med mätningar av ΔΦ på sfäriska celler och celler av mer komplexa former, visar videon påverkan av cellens form på amplitud och geografiska fördelningen av ΔΦ. Således för sfäriska celler ΔΦ är nära en cosinus, i samförstånd med Schwan ekvation, medan det för mer komplicerade cell former den geografiska fördelningen av ΔΦ är mer intrikat [20] ...
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det slovenska forskningsinstitut med projektet Z2-9229 och program P2-0249. Denna video är den kompletterande material för "elektroporation-baserade tekniker och behandlingar" vetenskapliga verkstad och magisterexamen, som anordnas vartannat år av fakulteten för elektroteknik vid universitetet i Ljubljana, Slovenien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. Electropermeabilization of cell membranes. Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).
- Sersa, G., Miklavčič, D. Electrochemotherapy of tumours. JoVE. 22, (2008).
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
