Extern elektriskt fält inducerar en spänning på membranet i en cell kallas inducerad membranet spänning (ΔΦ). Genom att använda potentiometrisk dye di-8-ANEPPS, är det möjligt att mäta ΔΦ noninvasivt. Denna video visar protokoll för mätning ΔΦ med di-8-ANEPPS.
Placering av en cell i ett yttre elektriskt fält orsakar en lokal inne i avgift omfördelning och utanför cellen i närheten av cellmembranet, vilket resulterar i en spänning över membranet. Denna spänning kallas inducerad membranet spänning (även inducerad transmembrana spänning, eller inducerad transmembrana potentialskillnad) och betecknas med ΔΦ existerar bara så länge som det yttre fältet är närvarande. Om den vilande spänningen är närvarande på membranet, överlagrar den inducerade spänningen (lägger till) på den. Genom att använda en av de potentiometrisk fluorescerande färger, såsom di-8-ANEPPS är det möjligt att observera varianter av ΔΦ på cellmembranet och att mäta dess värde noninvasivt. di-8-ANEPPS blir starkt fluorescerande när bundet till membranet av cellmembranet, med byte av fluorescensintensiteten proportionell mot förändringen av ΔΦ. Denna video visar protokoll för mätning ΔΦ med di-8-ANEPPS och visar påverkan av cellens form på amplitud och geografiska fördelningen av ΔΦ.
Mätningar av inducerad membranet (transmembrana) spänning, ΔΦ, kan vara viktiga i olika experimentella inställningar, t ex studier av spänningskänsliga membran kanaler, aktionspotential förökning, hjärt-cell stimulering eller cellmembran elektroporation [3, 4, 5, 6 , 7]. Med enkla cellen former kan ΔΦ beräknas analytiskt. Till exempel för en sfärisk cell är ΔΦ ges av Schwan s ekvation som säger att spänningen är proportionell mot fältstyrkan och cellstorlek och följer cosinus funktion längs membranet [8, 9]. För mer komplicerade cell former kan ΔΦ avvika avsevärt från cosinus och måste bestämmas antingen numeriskt med hjälp av en dator [2, 10, 11], eller experimentellt, med hjälp av en potentiometrisk färgämne [12, 13, 14, 15].
En av de potentiometrisk färgämnen allmänt används för detta ändamål är di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naphthyl-etylen-pyridintvärbindningar-propyl-sulfonat), en snabb färg med excitation och emissionsspektra beroende på membranet spänning, som möjliggör noninvasiv observationer av variationer av ΔΦ på cellmembranet och att mäta dess värde. I denna video visar vi en experimentell metod för bestämning av ΔΦ genom att använda di-8-ANEPPS.
Färgen har utvecklats av professor Leslie Loew och medarbetare [13, 14] vid University of Connecticut och tillhör den klass av snabba respons färgämnen. di-8-ANEPPS är nonfluorescent i vatten och blir starkt fluorescerande när den införlivas i membranet av cellmembranet. En förändring av ΔΦ resulterar i en förändring av intramolekylära avgiften distribution och motsvarande ändringar i den spektrala profil och intensiteten i färgen s fluorescens. Fluorescensintensiteten av di-8-ANEPPS varierar proportionellt med förändringen av ΔΦ, svaret av färgen är linjär för spänningar mellan -280 mV till 250 mV [4, 16]. Relativt små förändringar i fluorescens av färgen, ojämn membranfärgning, och färgämnet internalisering gör di-8-ANEPPS mindre lämplig för absolut mätning av membran spänning, t.ex. dess vila komponent, även om sådana insatser har också rapporterats [17]. Det är dock lämplig för mätning av större förändringar i membranet spänning, såsom uppkomsten av inducerad membranet spänning i nonexcitable celler som utsätts för yttre elektriska fält [12, 13], eller potentialer åtgärder retbara celler [4, 5]. Även om det inte tillämpas här, gör di-8-ANEPPS också bestämning av ΔΦ genom ratiometrisk mätningar av fluorescens excitation [18] eller utsläpp [19], vilket ökar känsligheten av svaret och minskar de ovan nämnda effekter. Som di-8-ANEPPS fläckar membranet, kan den också användas tydligt som ett membran markör [2].
En av nackdelarna med färgen är att den är benägen att fotoblekning, så att långvarig exponering för starkt ljus bör undvikas. Kalibrering av färgen görs med antingen (i) kalium jonofor valinomycin och en uppsättning av olika kalium koncentrationer i externt medium [2,18], eller (ii) patch-clamp i spänning klämma läge [17].
Slutligen, med mätningar av ΔΦ på sfäriska celler och celler av mer komplexa former, visar videon påverkan av cellens form på amplitud och geografiska fördelningen av ΔΦ. Således för sfäriska celler ΔΦ är nära en cosinus, i samförstånd med Schwan ekvation, medan det för mer komplicerade cell former den geografiska fördelningen av ΔΦ är mer intrikat [20] …
Detta arbete stöddes av det slovenska forskningsinstitut med projektet Z2-9229 och program P2-0249. Denna video är den kompletterande material för "elektroporation-baserade tekniker och behandlingar" vetenskapliga verkstad och magisterexamen, som anordnas vartannat år av fakulteten för elektroteknik vid universitetet i Ljubljana, Slovenien.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye | |
pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium | |
Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium | |
fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | ||
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | ||
crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic | |
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic | |
Lab-Tek II | Nalge Nunc | 155379 | chamber | |
DC voltage supply | Elektro-Automatik | |||
microprocessor-controlled switcher | Custom made | |||
electrodes | Custom made | Pt/Ir |