Summary
Äußeres elektrisches Feld induziert eine Spannung an der Membran einer Zelle, bezeichnet die induzierte Membran-Spannung (ΔΦ). Mit Hilfe der potentiometrischen Farbstoff di-8-ANEPPS, ist es möglich, die ΔΦ-invasiv messen. Dieses Video zeigt das Protokoll für die Messung ΔΦ mit di-8-ANEPPS.
Abstract
Die Platzierung einer Zelle in ein äußeres elektrisches Feld bewirkt eine lokale Ladungsumverteilung innerhalb und außerhalb der Zelle in der Nähe der Zellmembran, wodurch eine Spannung über der Membran. Diese Spannung, bezeichnet die induzierte Membran-Spannung (auch induzierte transmembrane Spannung oder induzierten transmembrane Potentialdifferenz) und bezeichnet durch ΔΦ, existiert nur, solange das externe Feld vorhanden ist. Wenn der ruhende Spannung wird auf der Membran, überlagert die induzierte Spannung (ergänzt) auf sie. Durch die Verwendung einer der potentiometrischen Fluoreszenzfarbstoffe, wie Di-8-ANEPPS, ist es möglich, die Schwankungen der ΔΦ auf der Zellmembran zu beobachten und ihren Wert nicht-invasiv zu messen. di-8-ANEPPS wird stark fluoreszierenden, wenn die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran gebunden ist, mit der Änderung der Fluoreszenzintensität proportional zur Änderung des ΔΦ. Dieses Video zeigt das Protokoll für die Messung ΔΦ mit di-8-ANEPPS und zeigt auch den Einfluss der Zellform auf die Amplitude und die räumliche Verteilung von ΔΦ.
Protocol
Teil I: Vorbereitende Schritte
- In diesem Experiment chinesischen Hamsters (CHO-K1) verwendet wird. Die Zellen werden in Lab-Tek II Kammern (2 Brunnen, 4 cm je 2) (Nalge Nunc, Deutschland) bei ~ 0.7x10 5 Zellen / ml in HAM-F12 Kulturmedium mit 8% fötalem Kälberserum, 0,15 mg / ml beschichtet L-Glutamin, 16 mg / ml Gentamycin (alle von Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) und 200 Einheiten / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Kroatien) und inkubiert in 5% CO 2 bei 37 ° C. Alternativ können die Zellen auch auf # 1 Glasdeckgläschen (0,13 bis 0,16 mm dick), mit einer zellulären Klebstoffs wie Polylysin beschichtet werden.
- Inkubieren Sie die Zellen in ihrem Kulturmedium. Inkubation dauert 2 bis 4 Stunden liefert Zellen, die noch annähernd kugelförmige, sondern fest auf der Oberfläche mit einem kleinen Teil ihrer Membran angebracht. Alternativ kann nach 16 bis 20 Stunden Inkubation werden die Zellen vollständig auf der Oberfläche angebracht und haben komplexere Formen, aber die meisten von ihnen sind noch nicht geteilt.
- Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) durch Zugabe von 843 l DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) bis 5 mg des Farbstoffs in der ursprünglichen Invitrogen Durchstechflasche. Die Stammlösung kann in einem Kühlschrank bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert. Vor Beginn der Experimente, erwärmen die die Lösung, bis die Kristalle von DMSO auflösen.
- Einige Zelllinien können die Verwendung von Pluronic, um den Farbstoff Einbau in die Zellmembran erleichtern. Pluronic kann in 20% Stammlösung in DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), oder eine Stammlösung der gleichen Konzentration kann durch Lösen von Pluronic in DMSO vorbereitet gekauft werden. Stammlösung von Pluronic kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
Teil II: Das Laden der Zellen mit di-8-ANEPPS
- Mix 3 ul 10 mM di-8-ANEPPS und 2,5 ul 20% Pluronic in 1 ml der Spinner Modifikation (Calcium-abgereicherten Version) des Minimum Essential Medium SMEM (medium M8167 oder M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland ) in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Dies ergibt eine "loading solution" mit etwa 30 uM di-8-ANEPPS und 0,05% Pluronic. Für andere Zelltypen, können ihre eigene Kultur Medien statt SMEM verwendet werden.
- Ersetzen Sie das Kulturmedium in den Lab-Tek Kammer mit dem Be-Lösung. Übertragen Sie die Kammer wieder in den Kühlschrank für 10 min bei 4 ° C. Bei dieser Temperatur ist die Internalisierung der Farbstoff durch die Plasmamembran weitgehend gehemmt.
- Nach der Färbung, vorsichtig waschen die überschüssige Farbe zwei vor drei Mal mit reinem SMEM.
- Lassen Sie 1,5 ml SMEM in der Kammer.
Teil III: Experiment und Bildaufnahme
- Die Zellen werden beobachtet mit einem Fluoreszenzmikroskop (in unserem Fall Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Deutschland) mit einem Ölimmersionsobjektiv (x63, NA 1,4), einem Monochromator (Polychrome IV, Visitron, Deutschland) und eine gekühlte CCD-Kamera (VisiCam ausgestattet 1280, Visitron, Deutschland). Die Bilder werden mit MetaFluor 7.1.1 erfasst und verarbeitet in MetaMorph 7.1.1 (beide Molecular Devices, Downingtown, PA, USA), aber auch andere ähnliche Software zur Erfassung kann ebenfalls verwendet werden. Stellen Sie die Anregungswellenlänge in der Software zur Erfassung bis 490 nm, und wählen Sie einen geeigneten Emissions-Filter für ANEPPS, zum Beispiel ein Band-Pass-Filter bei 605 nm zentriert (605/55m, dichroitische 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, USA). Wenn ein Monochromator nicht verfügbar ist, kann ein Anregungsfilter bei 490 nm zentriert verwendet werden.
- Setzen Sie die Kammer mit Zellen auf dem Mikroskoptisch, Position der Elektroden am Boden der Kammer und verbinden sie mit dem Impulsgenerator. Das Medium sollte sich auf den Elektroden.
- Zur Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit der Zellen und reduziert die Erwärmung, sollte der Puls niedrig genug Amplitude und kurzer Dauer sein. In diesem Experiment ein Rechteckimpuls mit 35 V Amplitude und 50 ms Dauer (niedrig genug, um Elektroporation zu vermeiden) wird unter Verwendung einer DC-Spannungsversorgung und eine maßgeschneiderte Mikroprozessor gesteuerten Umschalter Gerät. Alternativ kann auch eine kommerzielle Impulsgeber, wie 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) an einen Verstärker oder eine kommerzielle Stimulator, wie S88 (Grass, West Warwick, RI, USA) verbunden sind, verwendet werden können. Der Puls ist auf zwei parallel Pt / Ir-Draht-Elektroden mit 0,8 mm Durchmesser und 4 mm Abstand zwischen ihnen ausgeliefert, wodurch ein elektrisches Feld von etwa 88 V / cm zwischen den Elektroden und induzieren ΔΦ. Die genaue Feldverteilung zwischen den Elektroden in diesem Experiment verwendet wird an anderer Stelle [1] beschrieben.
- Finden Sie die Zellen von Interesse. Tragen Sie einen einzigen elektrischen Impuls oder eine Folge von Impulsen. Für jeden Impuls, die Übernahme zweier Fluoreszenzbilder: eine unmittelbar vor dem Puls (das Steuerelement Bild), und man während des Pulses (Puls-Bild). Aufgrund der geringen Reaktionszeit von di-8-ANEPPS, werden die Änderungen in der Fluoreszenz schwierig, mit bloßem Auge zu erkennen und sich zeigen only nach der Verarbeitung. Der Puls Lieferung muss mit der Bildaufnahme, die ein Merkmal der Akquisition Software synchronisiert werden. Um zu vermeiden, Ausbleichen und mögliche Erwärmung kann die Beleuchtung auf die Dauer des Impulses begrenzt werden.
Teil IV: Bildverarbeitung und-analyse
- Öffnen Sie die Bilder in MetaMorph Software. Für jeden Impuls, subtrahieren dem Hintergrund sowohl in der Kontrolle und der Puls Bild.
- Wählen Sie eine Zelle und stellen Sie die Region von Interesse, so dass es entspricht der Membran. Messen Sie die Fluoreszenz-Intensitäten entlang dieser Region in die Steuerungs-und Puls-Image und übertragen die Werte in eine Tabellenkalkulation.
- Für jeden Impuls, subtrahieren die Steuerdaten aus dem Impuls-Daten und teilt das Ergebnis durch Daten zur Steuerung der relativen Fluoreszenz Änderungen zu erhalten. Wenn eine Folge von Impulsen angewandt wird, können die Werte der relativen Fluoreszenz Änderungen für jeden Impuls bestimmt gemittelt, um eine zuverlässige Messung zu erhalten.
- Transform der relativen Fluoreszenz Änderungen in ΔΦ mit Hilfe einer Kalibrationskurve. Eine grobe Schätzung dieser Kurve kann aus der Literatur gewonnen werden, aber für höhere Genauigkeit, muss es für die jeweilige Einrichtung gemessen werden. Für die Zellen und das Setup in diesem Experiment verwendet eine 6% ige Abnahme der Fluoreszenz entspricht einem 100 mV Anstieg ΔΦ [2].
- Schließlich Plot die Spannung als Funktion der relativen Bogenlänge im Grafikrechner Software-Paket wie Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA), oder Origin (OriginLab Corp, Northampton, MA, USA). Die Kurve kann auch geglättet mit einem geeigneten Filter, wie der gleitende Durchschnitt zu filtern.
Discussion
Messungen der induzierten Membran (transmembrane) Spannung, ΔΦ, werden in verschiedenen experimentellen Settings, wie Studien von spannungsabhängigen Membran Kanäle, Aktionspotential Ausbreitung, Herz-Zell-Stimulation oder Zellmembran Elektroporation [3, 4, 5, 6 wichtige , 7]. Mit einfachen Zellformen kann ΔΦ analytisch berechnet werden. Zum Beispiel für eine kugelförmige Zelle, ist ΔΦ durch die Schwan-Gleichung, so dass die Spannung proportional zur Feldstärke und Zellgröße Staaten und folgt der Cosinus-Funktion entlang der Membran gegeben [8, 9]. Für kompliziertere Zellformen kann ΔΦ weichen deutlich von den Cosinus und müssen entweder numerisch bestimmt werden, mithilfe eines Computers [2, 10, 11], oder experimentell mit Hilfe eines potentiometrischen Farbstoff [12, 13, 14, 15].
Einer der potentiometrischen Farbstoffe häufig für diesen Zweck verwendet wird di-8-ANEPPS (di-8-Butyl-Amino-naphthyl-Ethylen-Pyridinium-propyl-sulfonat), eine schnelle Farbstoff mit Anregungs-und Emissionsspektren abhängig von der Membran-Spannung, welche ermöglicht nicht-invasive Beobachtung der Variationen des ΔΦ auf der Zellmembran und seinen Wert zu messen. In diesem Video zeigen wir einen experimentellen Ansatz zur Bestimmung von ΔΦ mit di-8-ANEPPS.
Der Farbstoff wurde durch Professor Leslie Loew und Kollegen [13, 14] entwickelt an der University of Connecticut und gehört zur Klasse der schnellen Reaktion Farbstoffe. di-8-ANEPPS ist nichtfluoreszierenden in Wasser und wird stark fluoreszierenden, wenn es in die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran integriert. Eine Änderung ΔΦ ergibt sich eine Änderung der intramolekularen Ladungsverteilung und entsprechende Änderungen in den spektralen Profil und Intensität der Farbstoff-Fluoreszenz. Die Fluoreszenz-Intensität des di-8-ANEPPS variiert proportional zur Änderung des ΔΦ; die Reaktion des Farbstoffs ist linear für Spannungen im Bereich von -280 mV bis +250 mV [4, 16]. Relativ kleine Änderungen in der Fluoreszenz des Farbstoffes, unebene Membranfärbung und Farbstoff Internalisierung machen di-8-ANEPPS weniger geeignet für absolute Messungen von Membran-Spannung, z. B. seine Ruhestätte Komponente, obwohl diese Anstrengungen waren auch [17] berichtet. Es ist jedoch für die Messung von größeren Veränderungen in der Membran-Spannung, wie das Auftreten von induzierten Membran Spannung in nonexcitable Zellen, die äußere elektrische Felder [12, 13], oder Aktionspotentiale in erregbaren Zellen [4, 5]. Obwohl nicht angewendet hier, di-8-ANEPPS ermöglicht auch die Bestimmung von ΔΦ durch ratiometrische Messungen der Fluoreszenz-Anregung [18] oder Emission [19], die die Empfindlichkeit der Reaktion erhöht und die oben genannten Effekte. Als di-8-ANEPPS Flecken der Membran kann es auch deutlich, wie eine Membran-Marker verwendet werden [2].
Einer der Nachteile des Farbstoffes ist, dass es anfällig gegen Ausbleichen ist, so dass eine längere Exposition gegenüber dem starken Licht sollte vermieden werden. Die Kalibrierung der Farbstoff entweder mit (i) Kalium-Ionophor Valinomycin und eine Reihe von verschiedenen Kalium-Konzentrationen in externen Medium durchgeführt [2,18], oder (ii) Patch-Clamp-in Voltage-Clamp-Modus [17].
Schließlich mit den Messungen von ΔΦ auf sphärische Zellen und Zellen von komplexeren Formen, zeigt das Video den Einfluss der Zellform auf die Amplitude und die räumliche Verteilung von ΔΦ. So kugelförmigen Zellen ΔΦ ist in der Nähe eines Cosinus, im Einvernehmen mit Schwan-Gleichung, während für kompliziertere Zellformen die räumliche Verteilung der ΔΦ ist komplizierter [20] ...
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der slowenischen Research Agency mit Projekt-Z2-9229 und das Programm P2-0249 unterstützt. Dieses Video stellt die ergänzende Materialien für den "Elektroporation basierenden Technologien und Behandlungsmethoden" wissenschaftlichen Workshop und Aufbaustudium, halbjährlich von der Fakultät für Elektrotechnik an der University of Ljubljana, Slowenien organisiert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
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