Summary
बाहरी बिजली के क्षेत्र एक सेल की झिल्ली पर एक वोल्टेज लाती है, प्रेरित झिल्ली वोल्टेज (ΔΦ) करार दिया. Potentiometric di-8-ANEPPS डाई का उपयोग करके, यह संभव है ΔΦ noninvasively उपाय. इस वीडियो को मापने के लिए प्रोटोकॉल पता चलता है ΔΦ di-8-ANEPPS का उपयोग.
Abstract
एक बाहरी बिजली के क्षेत्र में एक सेल की नियुक्ति एक स्थानीय प्रभारी पुनर्वितरण के अंदर और कोशिका झिल्ली के आसपास के क्षेत्र में सेल के बाहर का कारण बनता है, झिल्ली भर में वोल्टेज में जिसके परिणामस्वरूप. इस वोल्टेज, झिल्ली वोल्टेज प्रेरित करार दिया (transmembrane भी प्रेरित वोल्टेज, या प्रेरित transmembrane क्षमता अंतर) और ΔΦ से चिह्नित ही मौजूद है के रूप में लंबे समय के रूप में बाहरी क्षेत्र मौजूद है. यदि आराम वोल्टेज झिल्ली पर मौजूद है, प्रेरित वोल्टेज पर superimposes (कहते हैं). Di-8-ANEPPS जैसे potentiometric फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग करके, यह संभव है कोशिका झिल्ली पर ΔΦ के रूपांतरों निरीक्षण और noninvasively इसकी कीमत को मापने. di-8-ANEPPS जोरदार फ्लोरोसेंट हो जाता है जब प्रतिदीप्ति ΔΦ के परिवर्तन करने के लिए आनुपातिक तीव्रता के परिवर्तन के साथ कोशिका झिल्ली के लिपिड bilayer बाध्य. इस वीडियो को मापने के लिए प्रोटोकॉल ΔΦ di-8-ANEPPS का उपयोग कर दिखाता है और भी आयाम और ΔΦ के स्थानिक वितरण पर कक्ष आकार के प्रभाव को दर्शाता है.
Protocol
भाग मैं: प्रारंभिक कदम
- इस प्रयोग में चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिका लाइन (चो-K1) प्रयोग किया जाता है. कक्ष लैब - टेक द्वितीय कक्षों (2 कुओं, 4 2 सेमी प्रत्येक) (Nalge Nunc, जर्मनी) में ~ 0.7x10 कोशिकाओं 5 / HAM-F12 संस्कृति माध्यम में मिलीलीटर 8% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक, 0.15 मिलीग्राम / एमएल पर चढ़ाया जाता है एल glutamine, 16 मिलीग्राम / एमएल gentamicin (सिग्मा Aldrich, Steinheim, जर्मनी से सभी), और 200 इकाइयों / एमएल Crystacillin (Pliva, ज़गरेब, क्रोएशिया), और 37 पर 5% सीओ 2 में incubated डिग्री सेल्सियस वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को भी # 1 गिलास को कवर (0.13 करने के लिए 0,16 मिमी मोटी) निकल जाता है, polylysine के रूप में एक सेलुलर चिपकने वाला के साथ लेपित पर चढ़ाया जा सकता है.
- उनकी संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं को सेते हैं. 2 से 4 घंटे पैदावार कोशिकाओं है कि अभी भी मोटे तौर पर गोलाकार है, लेकिन दृढ़ता से अपनी झिल्ली के एक छोटे से हिस्से के साथ सतह से जुड़ी स्थायी ऊष्मायन. वैकल्पिक रूप से, ऊष्मायन के 16 से 20 घंटे के बाद, कोशिकाओं को पूरी तरह सतह से जुड़ी हैं और अधिक जटिल आकार है, लेकिन उनमें से ज्यादातर अभी भी नहीं बांट रहे हैं.
- Di-8 ANEPPS (Invitrogen, यूजीन, ओरेगन, संयुक्त राज्य अमेरिका) के एक 10 मिमी शेयर समाधान मूल Invitrogen शीशी में डाई के 5 मिलीग्राम DMSO (सिग्मा Aldrich, Steinheim, जर्मनी) के 843 μl जोड़कर तैयार करें. शेयर समाधान 4 ° C पर एक रेफ्रिजरेटर में कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. शुरू करने से पहले प्रयोग, समाधान गर्म जब तक DMSO के क्रिस्टल को भंग.
- कुछ सेल लाइनों pluronic कोशिका झिल्ली में डाई समावेश आसानी का उपयोग की आवश्यकता हो सकती है. Pluronic DMSO (F-127, Invitrogen, यूजीन, ओरेगन, संयुक्त राज्य अमरीका) में 20% शेयर समाधान है, या DMSO में भंग pluronic द्वारा तैयार किया जा सकता है है एक ही एकाग्रता की एक शेयर समाधान में खरीदा जा सकता है है. Pluronic के स्टॉक समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
भाग द्वितीय: di-8-ANEPPS के साथ कोशिकाओं लोड हो रहा है
- मिक्स 10 मिमी di-8-ANEPPS और स्पिनर संशोधन के 1 मिलीग्राम (कैल्शियम समाप्त संस्करण) न्यूनतम आवश्यक मध्यम SMEM (M8167 मध्यम या M4767, सिग्मा Aldrich, Steinheim, जर्मनी में 20% pluronic 2.5 μl के 3 μl एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में). यह एक "लोड हो रहा है समाधान," लगभग 30 di-8-ANEPPS सुक्ष्ममापी और pluronic के 0.05% युक्त पैदावार. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए, उनके पैतृक संस्कृति मीडिया SMEM के बजाय प्रयोग किया जा सकता है.
- लोड हो रहा है समाधान के साथ लैब टेक कक्ष में संस्कृति के माध्यम से बदलें. 4 में 10 मिनट के लिए फ्रिज में चैम्बर स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस इस तापमान में प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से डाई के internalization काफी हद तक हिचकते हैं.
- धुंधला के बाद, धीरे अतिरिक्त डाई शुद्ध SMEM के साथ दो से तीन बार धो.
- चैम्बर में 1.5 मिलीलीटर SMEM के छोड़ दें.
भाग III: प्रयोग और छवि अधिग्रहण
- कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (हमारे मामले Zeiss AxioVert 200, Zeiss, जर्मनी में) एक तेल विसर्जन (x63, 1.4 एनए) उद्देश्य, एक monochromator (विचित्र चतुर्थ, Visitron, जर्मनी) और एक ठंडा सीसीडी (कैमरा VisiCam के साथ सुसज्जित का उपयोग करते हुए मनाया जाता है 1280, Visitron, जर्मनी). छवियों के साथ 7.1.1 MetaFluor अर्जित कर रहे हैं और MetaMorph 7.1.1 में संसाधित (आण्विक दोनों डिवाइसेज, Downingtown, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, संयुक्त राज्य अमेरिका), लेकिन अन्य समान अधिग्रहण सॉफ्टवेयर भी इस्तेमाल किया जा सकता है. अधिग्रहण 490 एनएम के लिए सॉफ्टवेयर में उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट और ANEPPS के लिए एक उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर, उदाहरण के लिए, 605 एनएम पर केंद्रित एक बैंड पास फिल्टर (605/55m, dichroic DCXR 565, Chroma, Rockingham, VT, संयुक्त राज्य अमरीका) का चयन करें. यदि एक monochromator उपलब्ध नहीं है, एक उत्तेजना 490 एनएम पर केंद्रित फिल्टर के बजाय प्रयोग किया जा सकता है.
- खुर्दबीन मंच पर कोशिकाओं के साथ प्लेस, चैम्बर चैम्बर के नीचे इलेक्ट्रोड की स्थिति और उन्हें पल्स जनरेटर कनेक्ट. मध्यम इलेक्ट्रोड को कवर किया जाना चाहिए.
- सेल व्यवहार्यता बनाए रखने और हीटिंग को कम करने के लिए, पल्स पर्याप्त कम आयाम और कम अवधि का होना चाहिए. इस प्रयोग में 35 वी आयाम और 50 एमएस की अवधि (काफी कम electroporation से बचने) के साथ एक वर्ग पल्स एक डीसी वोल्टेज की आपूर्ति और एक कस्टम निर्मित माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित स्विचर डिवाइस का उपयोग करते हुए उत्पन्न होता है. कर सकते हैं वैकल्पिक रूप से, 33210A (Agilent, सांता क्लारा, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) के रूप में एक वाणिज्यिक पल्स जनरेटर, एक एम्पलीफायर या S88 (घास, पश्चिम वारविक, आरआई, संयुक्त राज्य अमरीका) के रूप में एक वाणिज्यिक उत्तेजक, से जुड़ा इस्तेमाल किया जा. पल्स 0.8 मिमी व्यास और 4 मिमी उन दोनों के बीच दूरी के साथ दो समानांतर / पं. Ir तार इलेक्ट्रोड के लिए दिया है, उत्प्रेरण और ΔΦ इलेक्ट्रोड के बीच लगभग 88 वी / सेमी की एक बिजली के क्षेत्र बनाने के. इस प्रयोग में प्रयुक्त इलेक्ट्रोड के बीच सटीक क्षेत्र वितरण [1] कहीं वर्णित है.
- ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाएं. एक एकल बिजली नाड़ी या दालों के अनुक्रम लागू करें. तुरंत पल्स (नियंत्रण छवि) से पहले, एक और नाड़ी (पल्स छवि) के दौरान: प्रत्येक नाड़ी के लिए, दो प्रतिदीप्ति छवियों अधिग्रहण. Di-8-ANEPPS कम प्रतिक्रिया के कारण, प्रतिदीप्ति में परिवर्तन नग्न आंखों से विचार और स्पष्ट onl हो गया है मुश्किल कर रहे हैंy प्रसंस्करण के बाद. पल्स वितरण छवि अधिग्रहण, जो अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की एक विशेषता है के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए. Photobleaching और संभव हीटिंग से बचने के लिए, रोशनी नाड़ी की अवधि तक ही सीमित किया जा सकता है.
भाग IV इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण:
- MetaMorph सॉफ्टवेयर में छवियों को खोलें. प्रत्येक नाड़ी के लिए, दोनों नियंत्रण और नाड़ी छवि पृष्ठभूमि में घटाना.
- किसी कक्ष चुनें और ब्याज के क्षेत्र सेट इतना है कि यह झिल्ली से मेल खाती है है. उपाय नियंत्रण और नाड़ी की छवि में इस क्षेत्र के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता और एक स्प्रेडशीट के लिए मानों हस्तांतरण.
- प्रत्येक नाड़ी के लिए, पल्स डेटा से नियंत्रण डेटा घटाना, और रिश्तेदार प्रतिदीप्ति परिवर्तन प्राप्त नियंत्रण डेटा द्वारा परिणाम विभाजित है. यदि दालों के अनुक्रम लागू किया जाता है, रिश्तेदार प्रतिदीप्ति प्रत्येक नाड़ी के लिए निर्धारित परिवर्तन के मूल्यों के लिए एक और अधिक विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए औसतन किया जा सकता है.
- ΔΦ में रिश्तेदार प्रतिदीप्ति परिवर्तन एक अंशांकन वक्र का उपयोग कर रूपांतरण. इस वक्र की एक मोटा अनुमान साहित्य से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन उच्च सटीकता के लिए, यह प्रत्येक विशेष स्थापना के लिए मापा जा. कोशिकाओं और इस प्रयोग में प्रयुक्त सेटअप के लिए प्रतिदीप्ति में 6% की कमी एक 100 ΔΦ [2] में mV वृद्धि से मेल खाती है.
- अंत में, रेखांकन एक्सेल (माइक्रोसॉफ्ट कार्पोरेशन, रेडमंड, WA, संयुक्त राज्य अमेरिका), सिग्मा प्लॉट (Systat सॉफ्टवेयर, Inc सैन जोस, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका) के रूप में सॉफ्टवेयर पैकेज में रिश्तेदार आर्क लंबाई के एक समारोह के रूप में वोल्टेज की साजिश, या उत्पत्ति (OriginLab कार्पोरेशन, नॉर्थम्प्टन, MA, संयुक्त राज्य अमरीका). वक्र भी चल औसत फिल्टर के रूप में में एक उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर smoothed जा सकता है.
Discussion
प्रेरित transmembrane () झिल्ली वोल्टेज, ΔΦ, माप वोल्टेज gated झिल्ली चैनलों, कार्रवाई संभावित प्रसार, हृदय सेल उत्तेजना, या कोशिका झिल्ली [3 electroporation, 4, 5, 6 के अध्ययन के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग में महत्वपूर्ण हो सकता है , 7]. सरल सेल आकार के साथ, ΔΦ विश्लेषणात्मक गणना की जा सकती है. उदाहरण के लिए, एक गोलाकार सेल के लिए, ΔΦ Schwan s समीकरण है, जिसमें कहा गया है कि वोल्टेज क्षेत्र शक्ति और सेल आकार करने के लिए आनुपातिक है और झिल्ली के साथ कोसाइन समारोह के बाद के द्वारा दिया जाता है [8, 9]. ΔΦ अधिक जटिल सेल आकृतियों के लिए, काफी कोज्या से विचलित और या तो संख्यानुसार निर्धारित किया जाना चाहिए, एक कंप्यूटर [2, 10, 11], या प्रयोगात्मक का उपयोग करते हुए, एक potentiometric [12, 13, 14, 15] डाई का उपयोग कर सकते हैं.
Potentiometric व्यापक रूप से इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल रंगों di-8-ANEPPS (di-8-butyl - एमिनो naphthyl pyridinium - propyl sulfonate ethylene), उत्तेजना और उत्सर्जन झिल्ली वोल्टेज पर निर्भर स्पेक्ट्रा के साथ एक तेजी से डाई, जो कोशिका झिल्ली पर है और इसकी कीमत को मापने ΔΦ के रूपांतरों के noninvasive टिप्पणियों अनुमति देता है. इस वीडियो में, हम di-8-ANEPPS का उपयोग करके एक ΔΦ के निर्धारण के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण दिखा.
डाई प्रोफेसर लेस्ली Loew और [13, 14] उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय में तेजी से प्रतिक्रिया रंगों के वर्ग के अंतर्गत आता है है. di-8-ANEPPS पानी में nonfluorescent है और दृढ़ता फ्लोरोसेंट जब यह कोशिका झिल्ली के लिपिड bilayer में शामिल हो जाता है. Intramolecular प्रभारी वितरण और वर्णक्रमीय और डाई प्रतिदीप्ति का प्रोफ़ाइल तीव्रता में इसी बदलाव का एक परिवर्तन में ΔΦ परिणाम में बदल जाते हैं. di-8-ANEPPS प्रतिदीप्ति तीव्रता ΔΦ के बदलने के लिए आनुपातिक होता है; डाई की प्रतिक्रिया -280 एम वी से 250 को लेकर mV [4, 16] voltages के लिए रेखीय है. डाई, असमान झिल्ली धुंधला के प्रतिदीप्ति में अपेक्षाकृत छोटे परिवर्तन, और डाई internalization di-8-ANEPPS कम झिल्ली वोल्टेज, अपने आराम घटक जैसे की निरपेक्ष माप के लिए उपयुक्त बनाने के लिए, हालांकि इस तरह के प्रयासों को भी [17] सूचित किया गया. यह है, तथापि, जैसे nonexcitable बाहरी बिजली क्षेत्रों को उजागर कोशिकाओं में प्रेरित झिल्ली वोल्टेज की शुरुआत [12, 13], या कार्रवाई क्षमता उत्तेजनीय [4, 5] कोशिकाओं में झिल्ली वोल्टेज में बड़ा परिवर्तन, को मापने के लिए उपयुक्त है. हालांकि यहाँ लागू नहीं, Di-8-ANEPPS भी अनुमति देता है प्रतिदीप्ति उत्तेजना के ratiometric माप द्वारा ΔΦ के दृढ़ संकल्प [18] या उत्सर्जन [19] है, जो प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता बढ़ जाती है और abovementioned प्रभाव को कम कर देता है. Di-8-ANEPPS झिल्ली दाग के रूप में, यह भी एक झिल्ली मार्कर के रूप में स्पष्ट रूप से कर सकते हैं इस्तेमाल किया जा [2].
डाई की कमियां की है कि यह photobleaching करने के लिए प्रवण है, इसलिए है कि मजबूत प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचा जाना चाहिए. डाई के अंशांकन या तो (i) के पोटेशियम ionophore और बाहरी माध्यम से विभिन्न पोटेशियम सांद्रता का एक सेट valinomycin के साथ किया जाता है [2,18], या (ii) पैच दबाना वोल्टेज क्लैंप मोड में [17]
अंत में, गोलाकार कोशिकाओं और अधिक जटिल आकार की कोशिकाओं पर ΔΦ की माप के साथ, वीडियो ΔΦ के आयाम और स्थानिक वितरण पर कक्ष आकार के प्रभाव को दर्शाता है. इस प्रकार गोलाकार कोशिकाओं के लिए ΔΦ एक कोज्या के लिए करीब है, Schwan समीकरण के साथ समझौते में, जबकि अधिक जटिल सेल आकृतियों के लिए ΔΦ के स्थानिक वितरण और अधिक जटिल है [20] ...
Acknowledgments
यह काम Z2-9229 परियोजना और P2 0,249 कार्यक्रम के साथ स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी के द्वारा समर्थित किया गया था. इस वीडियो "electroporation आधारित टेक्नोलॉजीज और" वैज्ञानिक कार्यशाला और स्नातकोत्तर कोर्स, इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के संकाय द्वारा biannually Ljubljana, स्लोवेनिया विश्वविद्यालय में आयोजित उपचार के लिए पूरक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P.
- Sersa, G., Miklavčič, D.
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
