Summary
En demonstration av isolering av neonatal musen ryggmärgen för elektrofysiologiska studier.
Abstract
Den neonatala musen ryggmärgen är en modell för att studera utvecklingen av neurala kretsar och rörelseapparaten rörelse. Vi visar ryggmärgen dissekering och förbereda inspelningen bad konstgjorda cerebrospinalvätska används för rörelseapparaten studier. När dissekerade kan ryggmärgen ventrala nervrötterna knytas till en inspelning elektrod att registrera elektrofysiologiska signaler från den centrala mönstret generera kretsar i ländryggen sladden.
Protocol
1. Förbered konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF) 1. Vi förbereder först en 2L av en 10X lager av aCSF utan magnesium eller kalcium. Reagenser som anges i millimolar. Katalog Siffrorna hänvisar till Sigma / Aldrich.
| 2 liter 10X aCSF (utan Mg och Ca) | |||
| Reagens | mM | g/2L | Katalog |
| KCl | 40 | 5,96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1,38 | S-9638 |
| Glukos | 300 | 108,12 | D-9434 |
| Tillsätt destillerat vatten till 2L | |||
Vi kommer också att förbereda 1M lösningar av MgSO 4 och CaCl 2 i 50mL vatten för att möjliggöra justeringar i molaritet från experiment till experiment och att säkerställa kalcium förblir i lösning.
| 1M Kalcium och Lager Magnesium | |||
| Reagens | M | g/50mL | Katalog |
| CaCl 2 | 1 | 7,35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
Den aCSF lösningen måste gasas med carbogen (95% O2 / 5% CO2) för att sänka pH-värdet innan du lägger kalcium eller kalcium fälls.
| 1 Liter aCSF | |
| Reagens | Volym |
| 10X aCSF | 100mL |
| 1M CaCl 2 | 1 ml (dissekera) 2 ml (inspelning) |
| 1M MgSO 4 | 1 ml |
| Tillsätt ~ 800 ml destillerat vatten, gas med carbogen i 2 minuter innan du tillsätter kalcium | |
| Tillsätt destillerat vatten till 1L. | |
Den pumpar och slangar och dissekera rätter bör sköljas före och efter användning.
Dissection
Medan dissekera bör 1mm kalcium aCSF kontinuerligt gasats med carbogen. Den aCSF kan sugas från en flaska till dissekera skålen och pumpas från dissekera skålen till flaskan eller skickas till avfall. Vi använder en elastomer (Sylgard, Dow Corning) täckta skålen för att utföra dissekering.
Den neonatala musen snabbt halshuggen med skarp sax och ett snitt med en sax genom ventrala thorax och buk. Djuret är då urtagna. Den urtagna musen sköljs med aCSF. Djuret är sedan fästs på dissekera skålen med insekt stift in genom frambenen och vid basen av svansen.
Ryggraden avlägsnas genom att utföra en ventral laminektomi. Ryggraden hålls med liten pincett och ett blad av en liten sax skall införas omedelbart rygg till beniga ryggraden. Lamina skärs på ena sidan och sedan den andra samtidigt som du försiktigt lyfter beniga ryggraden. Detta görs för längden av ryggraden.
Ryggmärgen avlägsnas genom att skära längs båda sidor av ryggmärgen att skilja spinal nervrötterna och skär meningerna kring ryggmärgen. Vi skär till vänster och höger sida, då vi skär meningerna bifogas ryggsidan av ryggmärgen för att frigöra den. De isolerade sladden är sedan fästs på skålen nära aCSF inlopp för att säkra en god syretillförsel om ytterligare djur dissekeras.
De isolerade ryggmärgen överförs sedan till en inspelning maträtt med en liten sked eller spatel. Här har vi BEGJUTA beredningen med syresatt 2mm kalcium aCSF. Ryggmärgen är fästs på elastomer belagda skålen och micromanipulators används för att flytta extracellulära, hela elektroder rot sug nära rötterna. När elektroden tips är nära gratis roten slutet, är skonsam sugkraft gäller att dra roten till sug-elektroden. Denna process kan upprepas för att spela in flera rötter samtidigt.
Figur 1. Halshuggning och urtagning. A. Snabbt halshugga musen med vass sax. Större eller mindre bidrag från hjärnstammen kan uppnås beroende på graden av cut. B. Placera en bladet på saxen i öppningen av brösthålan som skapats av halshuggning. Öppna den ventrala thorax och buk till svansroten. Ta ut inälvorna och skölj med aCSF.
Figur 2. Borttagning av ryggraden. A. Sätt in den vänstra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggraden och ryggmärgen till höger i ryggmärgen och skär genom benen om ventrala till sladden. Sätt sedan in den högra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggraden och ryggmärgen till vänster i ryggmärgen och skär. B. Upprepa denna process samtidigt som försiktigt dra till ryggraden. Se till att inte punktera ryggmärgen genom att hålla i saxen på en låg vinkel.
Figur 3. Borttagning av ryggmärgen. A. Sätt in den vänstra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggmärgen och ben till höger om ryggmärgen och skär genom ryggraden rötter och hjärnhinnorna om lateralt sladden. Sätt sedan in den högra bladet på saxen i utrymmet mellan ryggmärgen och ben till vänster om ryggmärgen och skär genom spinala rötter och hjärnhinnorna om lateralt sladden. B. Slutligen försiktigt lyfta rostralt sladden och skär meningerna ansluter rygg sladden till lameller. Återigen se till att inte punktera ryggmärgen genom att hålla i saxen på en låg vinkel. Klipp inte rötterna för nära ryggmärgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De isolerade neonatal ryggmärgen ger en lätthanterlig metod för att studera nervsystemet utveckling1, 2. Inom ländryggen ryggmärgen av neonatal gnagare, kan centrala mönster generera kretsar producera fiktiva förflyttning i närvaro av neurotransmittorer. Denna fiktiva rörelseorganen består av rytmiska ökad verksamhet, skurar, som produceras vid 0,2 till 0,5 Hz. Dessa brister är organiserade för att producera vänster-höger växlingen längs sladden och böj-extensor växling (ipsilaterala L2 förhållande till L5). Flera genetiska mutationer på möss har visat sig ha onormalt beteende 3-5. Förstå hur neurala kretsar i ryggmärgen ändras under utveckling och genetiska störningar kommer att informera studier av neurala kretsar någon annanstans i CNS.
Det är anmärkningsvärt att det finns flera standard aCSF lösningar används regelbundet. Nedan finns en tabell över vanliga aCSF preparat.
Tabell 1: Vanliga aCSF Kompositioner
| Laboratorium | aCSF sammansättning i MM |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, 4 KCl, 1,5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 glukos. |
| Goulding, Keihn (5) | 111 NaCl, 3,08 KCl, 2,52 2 CaCl, 1,25 MgSO 4, 1,18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 glukos |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, 1,9-3,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 2,4 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 glukos |
| Ziskind-Conhaim Dissection (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glukos |
| Ziskind-Conhaim Extracellulär (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glukos. |
| O'Donovan, chick (8,9) | 139 NaCl, 2,9-5 KCl, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 glukos |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djurvård
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff är professor i laboratorier Gene Expression vid The Salk Institute för biologiska studier och en utredare vid Howard Hughes Medical Institute. Detta arbete stöddes av Christopher och Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker och Mike Sullivan i multimedia vid Salk Institute bistått med fotografi och redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
