Summary
Een demonstratie van de isolatie van neonatale muis ruggenmerg voor elektrofysiologische studies.
Abstract
De neonatale muis ruggenmerg is een model voor het bestuderen van de ontwikkeling van neurale schakelingen en bewegingsapparaat beweging. Tonen we aan het ruggenmerg dissectie en de voorbereiding van de opname bad kunstmatige cerebrospinale vloeistof die gebruikt wordt voor de motorische studies. Eenmaal ontleed, kan het ruggenmerg ventrale zenuwwortels worden aangesloten op een registratie-elektrode naar de elektrofysiologische signalen van de centrale patroon genereren circuit record in de lumbale snoer.
Protocol
1. Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) 1. We hebben eerst voor te bereiden een 2L van een 10X voorraad aCSF zonder magnesium of calcium. Reagentia genoemd in millimolaire. Catalogus nummers verwijzen naar Sigma / Aldrich.
| 2 liter 10X aCSF (zonder Mg of Ca) | |||
| Reagens | mM | g/2L | Catalogus |
| KCl | 40 | 5.96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1.38 | S-9638 |
| Glucose | 300 | 108,12 | D-9434 |
| Voeg gedestilleerd water aan 2L | |||
We zullen ook voor te bereiden 1M oplossingen van MgSO 4 en CaCl 2 in 50 ml water toe te staan voor aanpassingen in molariteit van experiment om te experimenteren en te zorgen voor de calcium in oplossing blijft.
| 1M Calcium en Magnesium Stocks | |||
| Reagens | M | g/50mL | Catalogus |
| CaCl 2 | 1 | 7.35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
De aCSF oplossing moet worden vergast met carbogen (95% O2 / 5% CO2) om de pH-waarde voor het toevoegen van calcium of calcium zal de neerslag lager.
| 1 Liter aCSF | |
| Reagens | Volume |
| 10X aCSF | 100 ml |
| 1M CaCl 2 | 1 ml (ontleden) 2 ml (opname) |
| 1M MgSO 4 | 1 mL |
| Voeg ~ 800 ml gedestilleerd water, gas met carbogen gedurende 2 minuten voor het toevoegen van calcium | |
| Voeg gedestilleerd water aan 1L. | |
De pompen en slangen en ontleden van gerechten moet worden gespoeld voor en na gebruik.
Ontleding
Tijdens het ontleden, moet 1 mM calcium aCSF continu worden vergast met carbogen. De aCSF kan worden overgeheveld uit een fles aan het ontleden schotel en gepompt uit het ontleden schotel naar de fles of naar afval. We maken gebruik van een elastomeer (Sylgard, Dow Corning) gecoate schaal aan de dissectie uit te voeren.
De neonatale muis is snel onthoofd met een scherpe schaar en een incisie gemaakt met een schaar door het ventrale thorax en de buik. Het dier wordt dan ontdaan van de ingewanden. De ingewanden muis wordt gespoeld met aCSF. Het dier wordt vervolgens vastgemaakt aan het ontleden gerecht met insecten pinnen ingebracht door de voorpoten en aan de basis van de staart.
De wervelkolom wordt verwijderd door het uitvoeren van een ventrale laminectomie. De wervelkolom wordt gehouden met kleine tang en een blad van een klein schaartje wordt direct dorsaal van de benige wervelkolom. De lamina is afgesneden aan de ene kant en dan de andere, terwijl zachtjes het opheffen van de benige wervelkolom. Dit is uitgevoerd voor de lengte van de wervelkolom.
Het ruggenmerg wordt verwijderd door te snijden langs beide zijden van het ruggenmerg naar de spinale zenuwwortels te verbreken en de meningen rond het ruggenmerg te snijden. We bezuinigen op de linker-en rechterkant, dan snijden we de meningen aan de dorsale zijde van het ruggenmerg te bevrijden. De geïsoleerde snoer wordt dan vastgemaakt aan de schotel bij de aCSF inlaat naar een goede oxygenatie te verzekeren als extra dieren worden ontleed.
De geïsoleerde ruggenmerg wordt dan overgebracht naar een opname schotel met behulp van een lepel of spatel. Hier hebben we perfuseren de voorbereiding met zuurstofrijk 2 mM calcium aCSF. Het ruggenmerg is vastgemaakt aan het elastomeer gecoate schaal en micromanipulators gebruikt voor het extracellulaire, hele wortel zuig-elektroden te verplaatsen in de buurt van de wortels. Wanneer de punt van de elektrode ligt dicht bij het gratis wortel einde, is zacht zuigkracht toegepast op de wortel te trekken in de aanzuig-elektrode. Dit proces kan worden herhaald om tegelijkertijd op te nemen meerdere wortels.
Figuur 1. Onthoofding en verwijderen van de ingewanden. A. Snel onthoofden van de muis met scherpe schaar. Meer of minder bijdragen van de hersenstam kan worden bereikt, afhankelijk van het niveau van de snede. B. Plaats een blad van de schaar in de opening van de borstholte gemaakt door de onthoofding. Open de ventrale thorax en de buik naar de basis van de staart. Verwijder de ingewanden en spoel af met aCSF.
Figuur 2. Verwijdering van de wervelkolom. A. Plaats de linker blad van de schaar in de ruimte tussen de wervelkolom en het ruggenmerg aan de rechterkant van het ruggenmerg en dwars door de botten leggen ventrale aan het snoer. Steek vervolgens het recht blad van de schaar in de ruimte tussen de wervelkolom en het ruggenmerg aan de linkerkant van het ruggenmerg en snijd. B. Herhaal dit proces, maar het toepassen van lichte tractie aan de wervelkolom. Zorg ervoor dat u doorboren het ruggenmerg door houden de schaar op een lage hoek.
Figuur 3. Verwijdering van het ruggenmerg. A. Plaats de linker blad van de schaar in de ruimte tussen het ruggenmerg en de botten aan de rechterkant van het ruggenmerg en dwars door de spinale wortels en de hersenvliezen leggen lateraal van het snoer. Steek vervolgens het recht blad van de schaar in de ruimte tussen het ruggenmerg en de botten aan de linkerkant van het ruggenmerg en dwars door de spinale wortels en de hersenvliezen leggen lateraal van het snoer. B. Tot slot, til de rostrale koord en knip de hersenvliezen het aansluiten van de dorsale koord aan de laminae. Nogmaals let er dan op doorboren het ruggenmerg door houden de schaar op een lage hoek. Knip niet de wortels te dicht bij het ruggenmerg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geïsoleerde neonatale ruggenmerg biedt een handelbaar methode van de bestudering zenuwstelsel ontwikkeling1, 2. Binnen de lumbale ruggenmerg van neonatale knaagdieren, centrale patroon genereren circuits kunnen fictieve motoriek te produceren in de aanwezigheid van neurotransmitters. Deze fictieve motoriek bestaat uit ritmische toename van de activiteit, uitbarstingen, die geproduceerd worden op 0,2 tot 0,5 Hz. Deze uitbarstingen worden georganiseerd om links-rechts afwisseling te produceren over de lengte van het snoer en de flexor-extensor afwisseling (ipsilaterale L2 ten opzichte van L5). Een aantal genetische mutaties in muizen is aangetoond dat ze afwijkend gedrag 3-5 te hebben. Begrijpen hoe de neurale circuits van het ruggenmerg is veranderd tijdens de ontwikkeling en genetische storingen zal op de hoogte studies van neurale circuits elders in het CZS.
Het is opvallend dat er verschillende standaard aCSF oplossingen in regelmatig gebruik. Hieronder is een lijst van algemeen gebruikte aCSF preparaten.
Tabel 1: Vaak aCSF Composities
| Laboratorium | aCSF Compositie in mM |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, 4 KCl, 1,5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 glucose. |
| Goulding, Keihn (5) | 111 NaCl, KCl 3,08, 2,52 CaCl2, 1,25 MgSO 4, 1,18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 glucose |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, KCl 1.9-3.9, 1.2 KH 2 PO 4, 2,4 CaCl2, 1,3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 glucose |
| Ziskind-Conhaim Dissection (7) | 113 NaCl, KCl 3, een CaCl 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glucose |
| Ziskind-Conhaim extracellulaire (7) | 113 NaCl, KCl 3, 2 CaCl2, een MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glucose. |
| O'Donovan, chick (8,9) | 139 NaCl, KCl 2,9 tot 5, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl2, 12 glucose |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Animal Care
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff is een professor in de Gene Expression laboratoria in het Salk Instituut voor Biologische Studies en een onderzoeker in de Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd ondersteund door de Christopher Reeve Foundation en Dana. Joe Belcovson, Kent Schnoeker en Mike Sullivan in Multimedia Resources aan het Salk Institute hulp geboden met fotografie en bewerken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
