Summary
Una dimostrazione dell'isolamento di midollo spinale neonatale del mouse per studi elettrofisiologici.
Abstract
Il midollo spinale del mouse neonatale è un modello per studiare lo sviluppo della circuiteria neuronale e del movimento motorio. Dimostriamo la dissezione del midollo spinale e la preparazione del bagno di liquido cerebrospinale di registrazione artificiali utilizzati per gli studi locomotore. Una volta sezionato, l'radici nervose del midollo spinale ventrale può essere collegato a un elettrodo per la registrazione dei segnali elettrofisiologici del circuito centrale generando modello all'interno del midollo lombare.
Protocol
1. Preparare artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) 1. Per prima cosa preparare un 2L di uno stock di 10X aCSF senza magnesio o di calcio. Reagenti elencati in millimolare. I numeri di catalogo si riferiscono alla Sigma / Aldrich.
| 2 litri 10X aCSF (senza Mg o Ca) | |||
| Reagente | mM | g/2L | Catalogo |
| KCl | 40 | 5,96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149,61 | S-7653 |
| NaHCO 3 | 210 | 35,28 | S-6297 |
| NaH 2 PO 4 | 5 | 1,38 | S-9638 |
| Glucosio | 300 | 108,12 | D-9434 |
| Aggiungere acqua distillata per 2L | |||
Ci sarà anche preparare soluzioni 1M di MgSO 4 e CaCl 2 in 50mL di acqua per consentire adeguamenti molarità da esperimento a esperimento e per assicurare il calcio rimane in soluzione.
| Calcio 1M e degli stock di magnesio | |||
| Reagente | M | g/50mL | Catalogo |
| CaCl 2 | 1 | 7,35 | C-5080 |
| MgSO 4 | 1 | 12,33 | M-5921 |
La soluzione aCSF deve essere gasati con CarboGen (95% O2 / 5% CO2) per abbassare il pH prima di aggiungere calcio o il calcio sarà precipitato.
| 1 litro aCSF | |
| Reagente | Volume |
| 10X aCSF | 100 ml |
| 1M CaCl 2 | 1 ml (dissezione) 2 ml (registrazione) |
| 1M MgSO 4 | 1 ml |
| Aggiungi ~ 800 mL di acqua distillata, gas con CarboGen per 2 minuti prima di aggiungere calcio | |
| Aggiungere acqua distillata a 1L. | |
Le pompe e tubi e piatti sezionare devono essere risciacquati prima e dopo l'uso.
Dissezione
Mentre dissezione, 1 mm di calcio aCSF deve essere continuamente gasati con CarboGen. Il aCSF può essere deviato da una bottiglia al piatto dissezione e pompato dal piatto dissezione alla bottiglia o inviato a rifiuti. Noi usiamo un elastomero (Sylgard, Dow Corning) piatto rivestito di eseguire la dissezione.
Il mouse neonatale è rapidamente decapitato con forbici affilate e una incisione fatta con le forbici attraverso il torace e l'addome ventrale. L'animale viene poi svuotato. Il mouse eviscerate è risciacquata con aCSF. L'animale è poi appuntata al piatto dissezione con perni insetti inserito attraverso la arti anteriori e alla base della coda.
La colonna vertebrale viene rimossa eseguendo una laminectomia ventrale. La colonna vertebrale è tenuto con una pinza piccola e una lama di piccole forbici è inserito immediatamente dorsale alla colonna vertebrale. La lamina viene tagliato da un lato e poi l'altro mentre leggero sollevamento della colonna vertebrale. Questo avviene per la lunghezza della colonna vertebrale.
Il midollo spinale è stato rimosso dal taglio lungo entrambi i lati del midollo spinale per tagliare le radici dei nervi spinali e tagliare le meningi che circonda il midollo spinale. Abbiamo tagliato sui lati destro e sinistro, poi abbiamo tagliato le meningi attaccato al lato dorsale del midollo spinale per liberarlo. Il cavo isolato è poi appuntata al piatto in prossimità della presa aCSF per assicurare una buona ossigenazione se gli animali vengono sezionati aggiuntivi.
Il midollo spinale isolato viene trasferito in un piatto di registrazione con un cucchiaio o una spatola. Qui profumato la preparazione con aCSF ossigenato calcio 2mm. Il midollo spinale è appuntato il piatto rivestito in elastomeri e micromanipolatori utilizzato per spostare extracellulare, tutto elettrodi aspirazione radice vicino alle radici. Quando l'elettrodo è vicino alla fine radice libero, delicata aspirazione viene applicata per disegnare la radice nel elettrodo di aspirazione. Questo processo può essere ripetuto per registrare radici contemporaneamente.
Figura 1. Decapitazione e l'eviscerazione. A. Rapidamente decapitare il mouse con forbici affilate. Contributi più o meno dal tronco cerebrale può essere raggiunto a seconda del livello di taglio. B. Luogo una lama delle forbici nell'apertura della cavità toracica creato dalla decapitazione. Aprire il torace e l'addome ventrale alla base della coda. Rimuovere i visceri e sciacquare con aCSF.
Figura 2. La rimozione della colonna vertebrale. A. Inserire la lama delle forbici sinistra nello spazio tra la colonna vertebrale e del midollo spinale alla destra del midollo spinale e tagliare le ossa che ventrale del midollo. Quindi inserire la lama delle forbici a destra nello spazio tra la colonna vertebrale e del midollo spinale a sinistra del midollo spinale e taglio. B. Ripetere questo processo mentre si applica una leggera trazione alla colonna vertebrale. Fare attenzione a non forare il midollo spinale, tenendo le forbici con un angolo basso.
Figura 3. La rimozione del midollo spinale. A. Inserire la lama delle forbici sinistra nello spazio tra il midollo spinale e le ossa a destra del midollo spinale e tagliare le radici spinale e delle meningi che laterale per il cavo. Quindi inserire la lama delle forbici a destra nello spazio tra il midollo spinale e le ossa a sinistra del midollo spinale e tagliare le radici spinale e delle meningi che laterale per il cavo. B. Infine, sollevare delicatamente il midollo rostrale e tagliare le meningi collegare il cavo di dorsale per le lamine. Anche in questo caso non prendere cura di forare il midollo spinale, tenendo le forbici con un angolo basso. Non tagliare le radici troppo vicino al midollo spinale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'isolato midollo spinale neonatale fornisce un metodo di studio trattabili sviluppo1 sistema nervoso, 2. All'interno del midollo spinale lombare di roditori neonatale, centrale circuito generando modello in grado di produrre locomozione fittizia in presenza di neurotrasmettitori. Questo locomozione fittizio costituito da un aumento dell'attività ritmica, scoppi, che vengono prodotte a 0,2-0,5 Hz. Queste esplosioni sono organizzati per la produzione di alternanza destra-sinistra per tutta la lunghezza del cavo di alternanza e flessori-estensori (omolaterale rispetto L2 a L5). Diverse mutazioni genetiche nei topi hanno dimostrato di avere comportamenti anomali 3-5. Capire come i circuiti neurali del midollo spinale è alterato durante lo sviluppo e perturbazioni genetiche informerà studi di circuiti neurali in altre parti del sistema nervoso centrale.
È da notare che ci sono parecchie soluzioni standard aCSF di uso comune. Di seguito una tabella di uso comune preparati aCSF.
Tabella 1: Composizioni aCSF
| Laboratorio | Composizione aCSF in mM |
| Pfaff, O'Donovan, Landmesser (3) | 128 NaCl, 4 KCl, 1,5 CaCl 2, 1 MgSO 4, 0,5 NaH 2 PO 4, 21 NaHCO 3, 30 di glucosio. |
| Goulding, Keihn (5) | 111 NaCl, 3.08 KCl, CaCl 2 2,52, 1,25 MgSO 4, 1,18 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 di glucosio |
| Brownstone (6) | 127 NaCl, KCl 1,9-3,9, 1,2 KH 2 PO 4, 2.4 CaCl 2, 1,3 MgCl 2, 26 NaHCO 3, 10 di glucosio |
| Ziskind-Conhaim Dissection (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2, 6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 di glucosio |
| Ziskind-Conhaim extracellulare (7) | 113 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 11 glucosio. |
| O'Donovan, pulcino (8,9) | 139 NaCl, KCl 2,9-5, 17 NaHCO 3, 1 MgCl 2, 3 CaCl 2, 12 di glucosio |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CURA DEGLI ANIMALI
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff è docente nei Laboratori di espressione genica presso il Salk Institute for Biological Studies e un investigatore della Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dal Christopher e Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan in Risorse Multimediale presso il Salk Institute ha fornito assistenza con la fotografia e montaggio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glucose | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| 1L volumetric flask | |||
| 100mL volumetric flask |
References
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
