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Biology

प्रतिवर्ती Biotinylation द्वारा प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Endocytic दरें माप

doi: 10.3791/1669 Published: December 23, 2009

Summary

नियमित endocytosis कोशिका की सतह झिल्ली प्रोटीन के बहुमत की अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करता है. यहाँ हम कम करने योग्य, झिल्ली impermeant biotinylation dopamine ट्रांसपोर्टर (DAT), एक polytopic झिल्ली प्रोटीन के endocytic दर को मापने के अभिकर्मकों का उपयोग. विधि सबसे प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के endocytic दर को मापने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण की सुविधा.

Abstract

प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन रिसेप्टर्स, आयन चैनल, ट्रांसपोर्टरों और पंप शामिल प्रोटीन के एक बड़े, विविध समूह हैं. इन प्रोटीनों की गतिविधि पोषक तत्व प्रसव, सेलुलर excitability, और रासायनिक संकेतन सहित प्रमुख सेलुलर घटनाओं की एक किस्म के लिए जिम्मेदार है. कई प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन गतिशील endocytic तस्करी, जो प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति फेरबदल करके प्रोटीन समारोह modulates द्वारा विनियमित रहे हैं. तंत्र है कि प्रोटीन endocytosis की सुविधा जटिल हैं और कई झिल्ली प्रोटीन के लिए पूरी तरह समझ नहीं है. आदेश में पूरी तरह से तंत्र है कि किसी दिए गए प्रोटीन के endocytic तस्करी नियंत्रण को समझने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन endocytic दर ठीक मापा जा. कई रिसेप्टर्स के लिए, प्रत्यक्ष endocytic दर माप अक्सर लेबल रिसेप्टर ligands उपयोग से प्राप्त कर रहे हैं. हालांकि, ट्रांसपोर्टरों, पंप और आयन चैनल के रूप में झिल्ली प्रोटीन के कई कक्षाओं के लिए, वहाँ कोई सुविधाजनक ligand है कि endocytic दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान रिपोर्ट में, हम एक पलटवाँ biotinylation विधि है कि हम डोपामाइन (DAT) ट्रांसपोर्टर endocytic दर को मापने के रोजगार का वर्णन. इस विधि internalization दरों को मापने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करता है, और आसानी से सबसे झिल्ली प्रोटीन की तस्करी के अध्ययन के लिए नियोजित कर सकते हैं.

Protocol

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प्रक्रिया अवलोकन:

इस दृष्टिकोण का प्रयोग, कोशिका की सतह प्रोटीन covalently उपलब्ध कोशिकी लाइसिन अवशेषों पर तस्करी प्रतिबंधक शर्तें (यानी कम तापमान) के तहत एक झिल्ली impermeant, डाइसल्फ़ाइड युग्मित biotinylation अभिकर्मक (sulfo एन एच एस - एस एस - बायोटिन) का उपयोग कर रहे हैं बायोटिन साथ लेबल (चित्र देखें 1. उदाहरण के लिए). कक्षों की एक सेट तस्करी अनुमोदक की स्थिति के लिए स्थानांतरित कर दिया है (37 डिग्री सेल्सियस) और biotinylated प्रोटीन internalize. कोशिकाओं के अन्य सेट 1) कुल समय = 0 पर सतह प्रोटीन, और 2) विपठ्ठन नियंत्रण के लिए नियंत्रण के रूप में कम तापमान पर रखा जाता है. Internalization की एक छोटी अवधि के बाद, कोशिकाओं को वापस कम internalization रोक तापमान को स्थानांतरित कर रहे हैं, और किसी भी अवशिष्ट सतह बायोटिन से कम करने एजेंट है, जो बायोटिन डाइसल्फ़ाइड युग्मित cleaves के साथ कोशिकाओं के इलाज से छीन लिया है. Biotinylated प्रोटीन है कि कोशिका की सतह से उठकर थे और भली भाँति विपठ्ठन कदम से संरक्षित कर रहे हैं, और केवल biotinylated प्रोटीन है कि रहने को किया जाएगा. सेल lysis के बाद, biotinylated प्रोटीन streptavidin आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कर रहे हैं और ब्याज की प्रोटीन मात्रात्मक immunoblotting से पता चला है. Endocytic दर निर्धारित करने के लिए, भली भाँति प्रोटीन की मात्रा कुल सतह समय = 0 लेबल नियंत्रण की तुलना में है. हम सफलतापूर्वक इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है neuronal एक norepinephrine और dopamine 1-4 ट्रांसपोर्टरों की internalization दर को मापने के.

विस्तृत प्रोटोकॉल:

दिन 1:

  1. 6 अच्छी तरह से जैसे कि वे ~ 80% मिला हुआ 2 दिवस के अवसर पर किया जाएगा प्लेटों में प्लेट कोशिकाओं. वैकल्पिक रूप से, अगर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जा रहा है, एक ऐसी है कि वे ~ 80% मिला हुआ समय internalization दर को मापा जाएगा पर किया जाएगा घनत्व transfect. यदि कोशिकाओं को दृढ़ता से पक्षपाती नहीं हैं, टिशू कल्चर के बर्तन एक कोशिका आसंजन (जैसे पाली-D-lysine) सब्सट्रेट करने के लिए व्यापक धोने चरणों के दौरान सेल नुकसान को रोकने के साथ इलाज किया जाना चाहिए.
  2. प्रत्येक प्रोटीन परीक्षण किया जा रहा है, एक प्लेट पर प्लेट 2 कुओं कुल सतह प्रोटीन (टी = 0) और विपठ्ठन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए. एक दूसरे की थाली पर, प्रत्येक internalization परीक्षण किया जा रहा हालत के लिए एक अच्छी तरह से थाली (यानी बेसल endocytic दर बनाम दवा इलाज).
  3. निम्नलिखित समाधान और 2 दिवस पर उपयोग के लिए संकेत तापमान पर दुकान तैयार:
    • 2 पीबीएस + फास्फेट खारा बफर (7.4 पीएच) 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.2 मिमी 2 CaCl, (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ पूरक
    • Biotinylation समाधान बुझाने: 2 पीबीएस + 100 मिमी ग्लाइसिन, (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ पूरक
    • NT बफर: 150 मिमी NaCl, 1.0 मिमी EDTA, 0.2% BSA, 20 मिमी Tris, 8.6 पीएच (4 डिग्री सेल्सियस)
    • Ripa बफर: 10 मिमी Tris, 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, 1.0 मिमी EDTA, 0.1% एसडीएस, 1.0% Triton एक्स 100, 1.0% सोडियम deoxycholate, (4 डिग्री सेल्सियस)
    • Sulfo एन एच एस - एस एस बायोटिन शेयर समाधान: dimethylsulfoxide में 200 मिलीग्राम / एमएल (-20 डिग्री सेल्सियस) (DMSO) भंग
    • Tris phosphine (2 Carboxyethyl) हाइड्रोक्लोराइड (TCEP) शेयर समाधान: एच 2 हे में 500 मिमी, (-20 डिग्री सेल्सियस, पन्नी में कवर प्रकाश ब्लॉक करने के लिए)

दिन 2:

  1. पीबीएस 2 + 0.18g/ml ग्लूकोज के साथ पूरक, 0.2% / आईजीजी protease मुक्त गोजातीय सीरम albumin (2 पीबीएस + / छ / BSA). तैयार पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इस समाधान.
  2. बेंच शीर्ष पर शेयर sulfo एन एच एस - एस एस - बायोटिन समाधान का पहले गला लें DMSO पिघल. तुरंत उपयोग करने के लिए पहले, ताजा समाधान sulfo एन एच एस - एस एस - बायोटिन (2.5 मिलीग्राम / बर्फ के ठंडे 2 पीबीएस + 0.75 के लिए पर्याप्त मिलीलीटर अच्छी तरह से / में मिलीलीटर) तैयार करते हैं. भंवर सख्ती समाधान DMSO solubilize. ध्यान दें कि एन एच एस-बायोटिन अभिकर्मक आसानी से जलीय घोल में hydrolyzed है. इसलिए, सभी समाधान तुरंत तैयार किया जाना चाहिए से पहले का उपयोग करने के लिए.
  3. Biotinylation: ठंडे कमरे में एक बर्फ स्नान पर प्लेस प्लेटें और बर्फ के ठंडे 2 पीबीएस के साथ 3 एक्स 2 मिलीलीटर कुल्ला . निश्चित है कि प्लेटों थोड़ा पूरा जल निकासी और बफर समाधान के हटाने के लिए अनुमति देने के लिए angled है. / ताजा sulfo एन एच एस - एस एस - बायोटिन प्रत्येक अच्छी तरह से हल की अच्छी तरह से 0.75 मिलीलीटर जोड़ें. सेते x 15, 4 ° सी जोरदार झटकों के साथ बर्फ स्नान पर. ऊष्मायन के बाद पूरा हो गया है, एक और नए समाधान sulfo एन एच एस - एस एस - बायोटिन तैयार करते हैं. ताजा समाधान और सेते एक्स 15 ', 4 डिग्री सेल्सियस के साथ पुराने समाधान बदलें
  4. शमन: यह महत्वपूर्ण है कि सभी गैर प्रतिक्रिया एनएचएस बायोटिन अणुओं बुझती हैं, इसलिए कि वे के साथ प्रतिक्रिया नहीं है और एक बार कोशिकाओं lysed रहे हैं intracellular प्रोटीन biotinylate है. कोशिकाओं शमन समाधान के साथ 3 एक्स 2 मिलीलीटर धो और 2 मिलीलीटर बुझाना x 15 'समाधान, 4 ° सी कोमल झटकों के साथ में दो बार सेते हैं.
  5. Internalization: यदि दवा उपचार परीक्षण किया जा रहा हैं, पीबीएस 2 + / छ / BSA उपयुक्त दवा एकाग्रता जोड़ने. 4 ° C पर नियंत्रण की थाली रखो और internalization थाली लाने ठंडे कमरे के बाहर. पूर्व गर्म पीबीएस 2 के साथ 3 एक्स 2 मिलीलीटर धो + / छ / BSA (+ / - डॉ.एक ही समाधान (2 मिलीलीटर अच्छी तरह /) में) UGS और छोड़ दें. पूर्व गर्म समाधान के साथ किसी भी खाली कुओं थाली भर में तापमान भी सुनिश्चित भरें. 10 'के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं स्थानांतरण. तुरंत 37 के अंत से पहले ° सी ऊष्मायन, NT बफर में ताजा 50 मिमी TCEP समाधान तैयार करने के लिए विपठ्ठन और बर्फ पर कदम की दुकान के लिए इस्तेमाल किया जा. 1.0 मिलीलीटर / अच्छी तरह के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करें.
  6. स्ट्रिपिंग: तुरंत हस्तांतरण बर्फ स्नान और ठंड के कमरे में लौटने के लिए प्लेट (ओं) . तेजी से बर्फ के ठंडे NT बफर, 3 के साथ कोशिकाओं को धो x 2 से endocytosis रोक मिलीलीटर. इसके अलावा NT बफर के साथ पट्टी नियंत्रण कुओं 3 एक्स 2 मिलीलीटर धो लो. 1.0 मिलीलीटर ताजा प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए विपठ्ठन समाधान जोड़ें. बर्फ पर सेते हैं, कोमल झटकों के साथ 15, 4 ° C. ताजा विपठ्ठन समाधान के साथ कुओं बदलें और बर्फ पर एक अतिरिक्त 15, 4 ° सी सेते हैं.
  7. Lysis: सभी कुओं कि विपठ्ठन समाधान, 3 एक्स 2 मिलीलीटर NT बफर से अवगत कराया गया धो लें. फिर सभी कुओं (कुल नियंत्रण सहित) के साथ 3 एक्स 2 मिलीलीटर 2 पीबीएस + धो लो. 300μl/well Ripa (या अन्य lysis बफर हित के प्रोटीन के लिए संगत) बफर ताजा protease inhibitors (1.0 मिमी PMSF, 1.0 μg / मिलीलीटर प्रत्येक leupeptin aprotinin और pepstatin) युक्त lyse. X 20 ', 4 डिग्री सेल्सियस मिलाते द्वारा lyse १८,००० XG, 10 ', 4 डिग्री सेल्सियस centrifuging द्वारा microfuge ट्यूब और स्पष्ट सेलुलर मलबे स्थानांतरण
  8. प्रोटीन एकाग्रता दृढ़ संकल्प: एक प्रोटीन अपने lysis स्थितियों (जैसे डीसी प्रोटीन परख, जैव रेड) के साथ संगत परख का उपयोग lysates के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए के रूप में एक मानक BSA वक्र की तुलना में.
  9. Streptavidin आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी: प्रत्येक नमूना के लिए प्रोटीन के बराबर मात्रा के साथ microfuge ट्यूबों तैयार है. Lysis बफर जोड़ें 200μl प्रत्येक नमूने के अंतिम मात्रा लाने के लिए. भंवर streptavidin agarose मोती सख्ती एक भी निलंबन के लिए लाने के लिए. टिप के साथ एक 200μl pipettor का उपयोग काट प्रत्येक ट्यूब में पिपेट मोती. 20μl beads/50 μg lysate की सिफारिश की. एक ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी पर रात भर, 4 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.

3 दिन:

  1. मनका धोने: अपकेंद्रित्र नमूने, 18,000 XG, 2 मोती इकट्ठा. बंद lysate Aspirate, सावधान किया जा रहा Aspirator साथ मनका गोली नहीं दृष्टिकोण. Aspirator के अंत पर बेहतर नियंत्रण के लिए एक प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग करें. 0.75 मिलीलीटर lysis प्रत्येक ट्यूब करने के लिए बफर, और मोती धोने भंवर जोड़ें. अपकेंद्रित्र नमूने, 18,000 XG, 2 से दोहराने और आकांक्षा मोती को इकट्ठा करने और दो बार धोने (कुल तीन washes). अंतिम धोने के बाद, मनका गोली परेशान करने के बिना के रूप में संभव के रूप में में बफर के ज्यादा aspirate. Aspirator ओर ट्यूब टिपिंग इस कदम के साथ मदद करता है.
  2. नमूना elution: प्रत्येक ट्यूब 20-25μl 2x Laemmli नमूना बफर (कम करने) जोड़ें. फोड़ना को कम करने एजेंट डाइसल्फ़ाइड बांड एन एच एस - एस एस - बायोटिन होगा, समाधान में पृथक प्रोटीन जारी. अधिकांश झिल्ली प्रोटीन अत्यधिक एकत्रीकरण की चपेट में जब उबला हैं, और गरम नहीं करना चाहिए एसडीएस पृष्ठ के लिए जैल पर लोड करने से पहले. ब्याज की अपने प्रोटीन की गर्मी संवेदनशीलता इन प्रयोगों प्रदर्शन करने से पहले निर्धारित है. यदि प्रोटीन / उबलते हीटिंग बर्दाश्त नहीं कर सकता, एक अंग को घुमानेवाली पेशी, 30, कमरे के तापमान पर पहले सेते एसडीएस पृष्ठ द्वारा विश्लेषण. यह फोड़ना डाइसल्फ़ाइड बांड करने के लिए पर्याप्त है और प्रोटीन elute.
  3. एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting: एसडीएस पृष्ठ से अलग प्रोटीन. प्रत्येक नमूने के लिए, यह आसान है निम्नलिखित क्रम में नमूने को चलाने: कुल सतह (समय = 0), पट्टी, internalization हालत # 1, हालत # 2, आदि immunoblotting के लिए झिल्ली के लिए स्थानांतरण और अपने प्रोटीन के लिए उचित एंटीबॉडी के साथ दाग ब्याज की. एक सीसीडी कैमरा जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर, निश्चित है कि वहाँ कोई संतृप्त पिक्सल किया जा रहा immunoreactive बैंड कैप्चर. प्रत्येक जेल सॉफ्टवेयर / विश्लेषण densitometry बैंड का उपयोग घनत्व यों.

प्रतिनिधि परिणाम:

एक प्रतिनिधि immunoblot परिणाम चित्रा 2A में दिखाया गया है. मजबूत संकेत "कुल" लेन (टी), जो सतह प्रोटीन की कुल राशि internalization के लिए पहले है में है. "पट्टी" नियंत्रण (एस) आदर्श रिक्त है, जो दर्शाता है कि पट्टी के प्रयोग के लिए कुशल था करने के लिए करीब होना चाहिए. पट्टी दक्षता गणना की है कि "कुल" लेन के लिए "पट्टी" लेन के घनत्व की तुलना करके (जैसे प्रोटीन है कि पट्टी के साथ समानांतर में biotinylated किया गया था, लेकिन था न तो 37 डिग्री सेल्सियस को गर्म और न ही विपठ्ठन समाधान को उजागर). निम्न सूत्र का उपयोग किया है:

[1 / पट्टी (कुल)] * 100%

इस सूत्र का उपयोग, चित्रा 2 में पट्टी 99.8% कुशल था. अंत में, आप internalization लेन में कुल (ओं) (मैं) की तुलना में कम तीव्रता के बैंड देखेंगे. उदाहरण में (चित्रा 2), इलाज कोशिकाओं या तो वाहन या 1μM एक 10 के दौरान phorbol myristate एसीटेट (PMA) के साथ इलाज किया गया प्रारंभिक internalization अवधि 'internalization और dopamine ट्रांसपोर्टर internalization दर एक 10 के लिए मापा गया. internalization दर के रूप में परिकलित किया जाता हैइस प्रकार है:

/ भली भाँति कुल * 100

चित्रा 2B में देखा, 10.4% की सतह DAT वाहन इलाज शर्तों के तहत 10 पर भली भाँति. PMA उपचार कुल सतह DAT के 23.2% के लिए DAT internalization दरों में वृद्धि हुई.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल चित्रण है प्रकोष्ठों 4 बजे biotinylated हैं ° सी सतह जनसंख्या विशेष रूप से लेबल के लिए, कर रहे हैं और 37 के लिए स्थानांतरित कर दिया ° सी internalization आरंभ करने के लिए. Internalization के बाद, कोशिकाओं के तेजी से endocytic प्रक्रियाओं और अवशिष्ट सतह बायोटिन रोक ठंडा कर रहे हैं एक एजेंट को कम करने के साथ कोशिकाओं के इलाज से छीन लिया है. केवल biotinylated प्रोटीन है कि रहने उन है कि t = 0 पर सतह से उठी और भली भाँति थे, इस प्रकार उन्हें विपठ्ठन उपचार से रक्षा कर रहे हैं. Biotinylated प्रोटीन streptavidin मोतियों के साथ बैच आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कर रहे हैं और ब्याज की प्रोटीन immunoblotting द्वारा पता चला है.

चित्रा 2
चित्रा 2. PKC सक्रियण DAT endocytic दर internalization परख बढ़ जाती है. PC12 stably DAT व्यक्त कोशिकाओं biotinylated थे, 4 डिग्री सेल्सियस के रूप में "विस्तृत प्रोटोकॉल" में वर्णित है. कोशिकाओं के तेजी से 37 तक गरम थे ° सी ± 1 सुक्ष्ममापी PMA और incubated 10, 37 डिग्री सेल्सियस अवशिष्ट बायोटिन को कम करने से छीन लिया, कोशिकाओं lysed थे और streptavidin आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा biotinylated प्रोटीन अलग थे. (ए) प्रतिनिधि immunoblot कुल सतह DAT दिखा = टी में (टी) 0, पट्टी नियंत्रण (एस), और संकेत की शर्तों के तहत भली भाँति DAT (मैं). (बी) बैंड एक सीसीडी कैमरे के साथ कब्जा कर लिया गया और साथ मात्रा निर्धारित मात्रा डाटा सॉफ्टवेयर (जैव रेड). डेटा% कुल DAT internalized/10 मिनट के रूप में व्यक्त कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. उदाहरण immunoblot एक गरीब बायोटिन पट्टी internalization. परख चित्रण. PC12 stably DAT व्यक्त कोशिकाओं biotinylated थे, 4 डिग्री सेल्सियस के रूप में "विस्तृत प्रोटोकॉल" में वर्णित है. कोशिकाओं के तेजी से 37 तक गरम थे डिग्री सेल्सियस और incubated 10, 37 डिग्री सेल्सियस अवशिष्ट बायोटिन को कम करने से छीन लिया, कोशिकाओं lysed थे और streptavidin आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा biotinylated प्रोटीन अलग थे. immunoblot कुल सतह DAT से पता चलता है टी में = (टी) 0, पट्टी नियंत्रण (एस), और भली भाँति DAT (मैं). नोट पट्टी नियंत्रण लेन में दिखाई बैंड, गरीब पट्टी दक्षता के संकेत.

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Discussion

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आम समस्याओं: सबसे आम समस्या यह है कि इन प्रयोगों में उठता गरीब पट्टी क्षमता है. पट्टी की दक्षता में परिणामों की व्याख्या करने में सक्षम किया जा रहा में महत्वपूर्ण है. जब तक पट्टी अत्यधिक कुशल था, यह निष्कर्ष है कि internalization गलियों में किसी भी biotinylated प्रोटीन वास्तव में थे, सतह से भली भाँति संभव नहीं है. ≥ 90% दक्षता स्ट्रिप्स इष्टतम कर रहे हैं, और हम किसी भी परिणाम त्यागें अगर पट्टी इस स्तर से नीचे गिरता है. एक गरीब पट्टी का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. ध्यान दें कि पट्टी लेन बैंड में काफी दिखाई देता है, और 34% की एक स्ट्रिप दक्षता के लिए मेल खाती है. यदि गरीब पट्टी क्षमता होते हैं, ताजा TCEP कोशिकाओं को जोड़ने से पहले नहीं है तुरंत किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, TCEP अपमानित हो सकता है और नए अभिकर्मक के लिए खरीदा जा आवश्यकता होगी हो सकता है. TCEP पाउडर का प्रयोग, समाधान के बजाय, इस समस्या को दरकिनार कर सकते हैं.

संभावित संशोधनों: वर्तमान रिपोर्ट में, हम एक रिश्तेदार DAT internalization दर internalization के प्रारंभिक 10 मिनट के पाठ्यक्रम पर लिया मापा, और DAT internalization की दर से यह PKC सक्रियण के दौरान की तुलना में . वैकल्पिक रूप से, एक पूर्ण दर समय अंक में वृद्धि करने के लिए वार्मिंग कोशिकाओं द्वारा मापा जा सकता है. हालांकि यह संभव हो सकता है है, हमारे अनुभव से पता चलता है कि समय अंक की जल्दी में कम संकेत स्तर के अंतर प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के साथ युग्मित, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम बहुत जल्दी समय अंक पर उपज नहीं है. इसके अलावा, हालांकि हम पक्षपाती कोशिकाओं का इस्तेमाल किया, परख सेल निलंबन के लिए संशोधित किया जा सकता है. Synaptosomes जैसे ऊतक निलंबन, यह भी इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह जरूरी है कि झिल्ली की अखंडता पहले की स्थापना की है. यदि तैयारी "टपका हुआ" झिल्ली की एक महत्वपूर्ण प्रतिशत है, biotinylation अभिकर्मक intracellular प्रोटीन लेबल और यह संभव नहीं हो मज़बूती से endocytic दर का निर्धारण करेगा. इस स्थिति में, immunoblots actin जैसे एक intracellular मार्कर प्रोटीन, के लिए भी जांच होना चाहिए, परीक्षण है कि क्या intracellular प्रोटीन पूल biotinylation अभिकर्मक को उजागर किया गया था.

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Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था # DA15169 हेम

References

  1. Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
  2. Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
  3. Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
  4. Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
प्रतिवर्ती Biotinylation द्वारा प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Endocytic दरें माप
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Gabriel, L., Stevens, Z., Melikian, H. Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation. J. Vis. Exp. (34), e1669, doi:10.3791/1669 (2009).More

Gabriel, L., Stevens, Z., Melikian, H. Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation. J. Vis. Exp. (34), e1669, doi:10.3791/1669 (2009).

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