Summary
식물의 특정 세포 유형을 분리하는 방법을 시연합니다. 이 기법은 특정 세포 유형, 세포 분리 및 형광 활성 세포에 형광 단백질 정렬을 표현 형질 마커 라인을 사용합니다. 또한, 성장의 설정은 치료를 용이하게되는 여기 설립
Abstract
높은 해상도, 유전자 발현의 세포 유형의 특정 분석은 크게 발달 규제 및 모든 다세포 생물 환경 자극에 반응의 이해를 향상시킵니다. 원위치 하이브리드화와 리포터 유전자의 시각화에서 양적이를 데 사용 제한 범위 수 있지만 높은 해상도 RT - PCR 또는 특정 세포 유형에서 높은 처리량 transcriptome - 다양한 분석 RNA의 격리가 필요한 것입니다. 특정 세포 유형과 후속 형광 활성 세포 정렬 (외과)에 형광 단백질 마커를 표현하는 조직의 세포 분리는 가능한 RNA 추출, cDNA 합성 / 증폭 및 microarray 분석을위한 자료의 충분한 양을를 수집합니다.
셀 유형 - 특정 형광 기자 라인의 광범위한 집합은 식물 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다. 이 경우, Arabidopsis thaliana 루트 두 마커 라인이 사용됩니다 : P SCR : GFP (endodermis 및 정지 센터)와 P WOX5 : GFP를 (정지 센터). 모종 많은 (수천) hydroponically 또는 한천 플레이트에 성장하고 추가 분석을 위해 충분한 루트 자료를 얻기 위해 수확하고 있습니다. 식물의 세포 분열은 세포 벽 소화 효소에 의해 이루어진다. 이 절차는 높은 osmolarity - 유도 plasmolysis 및 상용 cellulases을 사용하게, pectinases 및 hemicellulases이 솔루션에 protoplasts을 해제합니다.
GFP 양성 세포 외과는 488 nm의 레이저에 의해 흥분 protoplasts의 붉은 방출 스펙트럼 대 녹색의 시각화을 사용합니다. GFP 양성 protoplasts은 빨간색으로 방출하는 녹색들의 증가 비율로 구분할 수 있습니다. Protoplasts는 일반적으로 RNA 추출 버퍼에 직접 정렬하고 나중에 추가 처리를 위해 저장됩니다.
이 기술은 간단하고 실용적인 것으로 드러났습니다. 또한, 그것은 심지어 매우 부족한 세포 유형 (예 : 정지 중심 세포)에 대한, 그것이 transcriptome 분석을 위해 세포의 충분한 숫자를 분리하는 어려움없이 사용할 수 표시됩니다. 마지막으로, Arabidopsis 모종의 성장 설정은 그 (셀 타입 - 특정 biotic 또는 비생물적 스트레스 응답의 분석 예) 셀 정렬하기 전에 식물의 단순한 치료를 가능하게 증명합니다. 잠재적인 보조는 식물 protoplasts의 외과에 대해 설명합니다.
Protocol
식물 1) 준비
- Protoplasts는 효소를 소화 세포 벽의 오른쪽 혼합이 1을 사용된다는 가정하에 다양한 식물 종 및 조직에서 얻을 수 있습니다. 본격적인 실험이 수행되기 전에, 소재의 작은 규모의 소화는 조직의 protoplasting 효율성, 효소 등을 평가하고 셀 정렬에 대한 %로 긍정적인 세포를 추정하기 위해 좋습니다. 여기, 셀 타입 - 구체적으로 표현하는 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하는 Arabidopsis thaliana의 모종의 뿌리에서 파생된 protoplasts. endodermis와 정지 센터는 P SCR로 표시됩니다 : GFP와 P WOX5에 의해 정지 센터 : : GFP 2,3 (그림 1).
- 뿌리 (0.22 % W / V Murashige와 Skoog 기초 매체 [시그마], 1 %의 성장 매체로 통해 성장 수, 나일론 필터 (NITEX 250 μm의 메쉬)에, 모종은 (그림 2A 시그마) phytatrays에서 hydroponically 재배 W / V 자당, 0.05 % W / V MES [2 - (N - morpholino) ethanesulfonic의 산] 코와 산도 5.7). 또한, 식물이 수직으로 위치 1 % 한천 플레이트에 나일론 필터 (100 μm의 메쉬) (그림 2B) 위에 성장하실 수 있습니다.
- 원하는 경우 뿌리의 수확뿐만 아니라 에이즈 상기 필터의 사용은 또한, 묘목 쉽게 추가 치료를 용이하게합니다. 필터는 묘목이 관심의 촉매로 보충하거나 새로운 phytatrays 한천 플레이트에 EN 메스를 전송할 수 있습니다. 예를 들어, phytatray 설정은 최대 Arabidopsis 모종의 질소 치료 4 transcriptional 응답 세포 유형의 특정 분석에 사용되었습니다.
- 미세하여 형광 마커가 제대로 (자신이 치료에 의해 영향을받을 수있는 세포 유형 특정 마커로 치료 옵션을 사용하여 특히) 표시되었는지 확인하십시오. 이 경우에는 모종은 형광 현미경 (; 그림 1 니콘)에서 검사를하고 있습니다. 셀 유형 - 특정 형광 마커 라인이 정확하게 어떤 세포 유형이 표시됩니다 확인하고 표현의 다양성을 확인할 수 공촛점 현미경으로 처음 특성화되어야합니다.
protoplasting 솔루션의 2) 준비
- 1.25 % W / V Cellulase (Yakult), 0.3 % W / V Macerozyme (Yakult), 0.4 M D - mannitol, 20 MM MES와 demineralized 물 20 MM의 KCl을 (1 M 주식에서) 분해 및 5.7으로 산도를 조정 1 M 트리스 / HCL pH를 7.5로. 이 솔루션은 약간 흐린 것입니다.
- 55 솔루션을 열 ° C 10 분 동안 (솔루션은 분명 바뀔 것이다)와 0.1 %를 추가하기 전에 실온까지 식지 W / V BSA (소 혈청 알부민), 10 MM CaCl 2, 5 MM β - 메르 캅 토 에탄올 .
3) 착취 및 식물 재료의 protoplasting
- 뿌리는 메스와 나일론 메쉬 그들을 근근이 살아가고하여 수확과 protoplasting 솔루션을 포함하고있는 플라스크에 입금됩니다. 일반적으로, protoplasting 솔루션의 10 ML은 1500 세들링 뿌리마다 사용됩니다.
- 한 시간 만이라도 실온에서 부드럽게 flasks (75 RPM)를 흔들어. 더 이상 부화 시간은 원형질의 수율을 증가시킬 수 있습니다뿐만 아니라 유전자 발현에 대한 자체 protoplasting의 효과에 추가됩니다.
- 40 μm의 셀 스트레이너 (BD 팔콘)로 원형질 솔루션을 필터링하고 원뿔 15 ML 튜브 (BD 팔콘)을 통해 솔루션을 나눕니다.
- 이 원심 분리 속도가 사용된 protoplasts 종류의, 그들의 취약성과 효소 치료 기간 동안 생산 세포 파편의 크기에 따라 달라집니다 500 G. 주에서 10 분 동안 스윙 - 버킷 원심 분리기에 튜브를 스핀.
- 뜨는의 대부분을 제거 나머지 솔루션 protoplasts을 resuspend하고 (그림 3) 미세 그들을 검사합니다.
- protoplasts의 수와 밀도를 추정하는 hemacytometer을 사용합니다. 세포 밀도는 샘플 주입 속도, 외과에서 세포를 정렬하는 데 필요한 초 속도 당 행사와 따라서 전체 시간을 (또한 섹션 4.3 참조) 결정됩니다.
- 3.7)은 외과로 바로 이동하거나없이 W5 (154 MM NaCl, 125 MM CaCl2, 5 MM KCl, 5 MM MES, 코와 5.7으로 산도를 조정) 또는 protoplasting 솔루션으로 부화 솔루션에 protoplasts 씻고 resuspend거나 효소를 추가했습니다. transcriptional 변경보고 특히 때에는 protoplasts 그것은 따라서 protoplasting 솔루션 protoplasts를 유지하고 진행하는 것이 좋습니다 인치 보관하는 버퍼를 변경으로 유전자 발현에 영향을 미칠 수 조건에 샘플의 노출을 최소화하기 위해 중요 가능한 한 빨리 외과합니다.
protoplasts 4) 형광 활성 셀 정렬
- 전원을 켜고 세포 분류기를 준비합니다. 여기 FACSAria (BD)가 사용됩니다.
- 100 & M과 흐름을 설정U; m 노즐과 20 PSI의 드레스 압력.
- 세포 밀도와 샘플 사출 속도는 최상의 수율이나 빠른 속도를 원하는 달성 여부에 따라 특정 실험을 조정할 수 있습니다. 우리는 천만 셀 / ML 최대 밀도와 함께 성공적으로 정렬합니다.
- protoplasts의 침강을 방지하기 위해 외과에 샘플 교반 옵션을 사용합니다. 1 : 외과의 막히는 것은 문제가있다면, 세 가지 문제 해결 단계가 있습니다. 샘플 온라인 backflush를 수행합니다. 2. 밀도를 줄이기 위해 귀하의 원형질 현탁액을 희석. 3. 원심 분리 및 resuspension 후 여과 단계 (3.3)를 반복하여 원형질의 솔루션을 정리.
- 488 NM 레이저에 의해 여기 이후 붉은 스펙트럼 autofluorescence (RSA)에 GFP 및 20분의 610 nm의에 대한 30분의 530 nm의에서 앞으로 분산형 (FSC), 사이드 분산형 (SSC)와 방출을 측정하는 장치를 준비합니다. 이들은 본질적으로 GFP 양성 protoplasts을 분리하는 데 사용되는 유일한 매개 변수입니다. 여기 전압 설정은 다음과 같이되었습니다 : FSC - 60V, SSC 250V, 350V GFP 및 RSA 335V. 최적의 전압 설정은 모든 외과에 대해 서로 다른 것입니다 심지어 세포 분류기의 수명에 걸쳐 조정해야됩니다.
- 앞으로 산란 대 사이드 분산을위한 dotplot를 설정하여 시작합니다. 측정된 이벤트 줄거리 중심으로되도록 전압 설정을 적용합니다.
- 다음, 녹색 적색 형광 신호 대의 점 음모를 만들 수 있습니다. 야생 형 (비 GFP) 원형질의 정지를보고 때 측정 사건 줄거리의 중심 대각선 인구를 얻을 수 있도록 전압 설정을 적용합니다. GFP 표식 라인에서 파생된 원형질 서스펜션은 거친 타입 샘플에서 본 적이 녹색 형광 사건의 명확한 인구를 생성합니다.
- GFP와 RSA 사이의 스펙트럼 중복에 대한 조정 보상 제약을 설정합니다. 적절한 보상 제약 설정은 비 GFP의 protoplasts와 부스러기에서 GFP 양성 protoplasts보다 분리 수 있습니다. RSA, 마이너스 17.91 %의 GFP : 여기에 사용되는 제약 조건은 다음과 같다.
- 비 GFP의 protoplasts의 부정적인 컨트롤 게이트 경계 (그림 4) 정의에 투입 사용해야 GFP - 긍정적인 이벤트를 식별하기 위해 게이트를 설정합니다.
- 분석에서 작은 파편를 떠나하기 위해 앞으로 흩어 커토프를 구현합니다. 컷오프의 위치를 결정하는 데 도움이되도록 FSC 대 SSC의 음모에 GFP - 긍정적인 이벤트를 시각화. 여기서 단절는 5000으로 설정했습니다. 외과 조각이 높은 수준 정렬 행사와 샘플로 파편 계산됩니다이 예상보다 다른 %의 GFP 긍정적인 이벤트를 할 수 있습니다. 이것은 문제가 아니다. 그러나, 예제에서 더 많은 파편은 더 이상 정렬이됩니다.
- 실험 및 분석에 대한 셀 타입의 풍부한에 따라 정렬 세포의 최적의 수율이나 최적의 순도에 대한 어느 외과 정밀 모드를 설정합니다.
- RNA 추출을위한, RNA 추출 버퍼의 적절한 양의 컬렉션 튜브 (1.5 ML microfuge 튜브) 준비합니다. 이러한 설치로는, 20,000 정렬 이벤트 추출 버퍼 350 μl (RNeasy 마이크로 키트, QIAGEN)에 정렬되었습니다 약 100 μl의 총 볼륨을 얻을 것입니다. 정렬 완료 후 세포 현탁액은 상단에있는 수영장 수있는 샘플을 섞는다.
- 샘플을 저장하거나 추출 RNA로 바로 진행합니다. 성공 microarray 분석은 같은 작은 500 정렬 행사에서 추출한 RNA로 preformed되었습니다. 여기, 우리는 RNeasy 마이크로 추출 키트 (QIAGEN) WT - 오베이션 피코 RNA의 증폭 시스템 및 FL - 오베이션 cDNA 비오틴 모듈 V2 (NuGEN)를 사용합니다.
대표 결과
약 1500 한 주 된 P SCR 중 하나 phytatray가 : GFP의 모종은 60,000 protoplasts (같은 hemacytometer에 의해 측정)에 대한 굴복. 65,000 외과 - 처리 이벤트의 2.6 %는 GFP - 긍정적인 것으로 정의되었고 (그림 4B) 정렬되었습니다.
약 1,500 4 일 된 P WOX5의 여덟 접시 : GFP의 모종 각 (12,000 총) 30,000,000 protoplasts (같은 hemacytometer에 의해 측정)에 대한 굴복. 16,000,000 외과 - 처리 이벤트의 0.063 %의 GFP - 긍정적인 것으로 정의되었고 (그림 4C) 정렬되었습니다.
10,000 정렬 이벤트는 일반적으로 RNA 추출을 위해 사용되며 20 일부터 140 NG 총 RNA (그림 5)을 얻을 수 있습니다.
그림 1. Arabidopsis 루트에 셀 유형 특정 GFP 표지 라인. 형광 현미경 이미지는 미분 간섭 대비 (DIC) 및 Metamorph 소프트웨어 (분자 장치)에서 실행 이클립스 90i 현미경 (니콘)에 GFP 필터로 찍은되었습니다. DIC와 GFP 이미지 시각화 목적으로 겹쳐 있었다. 이 영상 실험에 사용되는 두 개의 마커 라인이 표시되며A) P SCR : GFP와 B) P WOX5 : GFP.
그림 2. 식물 성장 조건을. 모종은 phytatrays (A) 또는 수직 위치를 한천 플레이트 (B)에 hydroponically 환경 컨트롤러에서 성장했다.
그림 3. 플랜트 protoplasts는 GFP를 표현. 형광 현미경 이미지가 차등 간섭 대비 (DIC) 및 Metamorph 소프트웨어 (분자 장치)에서 실행 이클립스 90i 현미경 (니콘)에 GFP 필터로 찍은되었습니다. DIC와 GFP 이미지 시각화 목적으로 겹쳐 있었다. 화살표는 버스트 세포, 세포 파편 및 GFP 양성 원형질을 나타냅니다. 이 흰색 라인 사이의 거리는 50 μm의 수 있습니다.
그림 4. GFP 양성 protoplasts의 형광 활성 세포 분류 야생 유형 (A) P SCR에서 파생 Protoplasts이 :. : GFP (B) 또는 P WOX5 : GFP (C) 마커 라인이 FACSAria (BD)를 분석하고 정렬되었습니다 정의 게이트를 사용하여 대 레드 (20분의 610 NM; Y 축) 형광, 녹색 (X 축 30분의 530 NM)의 dotplot에. 100,000 이벤트가 각각의 음모에 제공됩니다. GFP의 분류 게이트 안에 떨어지는 이벤트가 녹색으로 강조 표시됩니다.
그림 5. 10.000 정렬 세포에서 RNA extractions 대표. 세포 RNA 추출 버퍼 (QIAGEN)에 직접 정렬되었습니다는 RNA는 정화와 2100 Bioanalyzer (애질런트)에 집중, 순도와 무결성을 확인했습니다. 두 마커 라인이 표시됩니다 세는 복제합니다.
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Discussion
Protoplasts는 원칙적으로 유리한 조건을 최적화하는 것은 크게 RNA의 품질과 수량을 향상시키는, 식물 조직의 다양한에서 파생된 수 있습니다. protoplasting 솔루션 및 사용 선택 부화 버퍼 모두이 부분에 영향을 미칠 것이다.
여러 가지 형광 단백질을 사용 외과의 기능에 따라 사용할 수 있습니다, 예를 들어 GFP, RFP, YFP, CFP하거나 많은 변종 및 파생 상품. 마커의 표현이 여기에 같이뿐 아니라 세포 유형의 특정 발기인 또는 확장기 트랩에 의해 구동뿐만 아니라, 여러분이 좋아하는 발기인에 의해 호르몬 응답 합성 리포터 유전자 5 예 수 있습니다. 식물 protoplasts의 듀얼 컬러 외과도 가능합니다. 형광 긍정적인 선택 마커 5 벡터를 사용하여 과도 변환 분석을 수행할 때이 예를 들어, 적용할 수 있습니다.
Protoplasts 또한 게놈 DNA, 단백질 또는 metabolites 6 분석을 위해 정렬할 수 있습니다. 정렬 후 살아 protoplasts을 지키는 게 더 큰 (130 μm의) 노즐과 낮은 칼집 압력을 사용하여, 그들의 연약한 자연으로 인해 도전과 최적 배양 버퍼로 그들을 정렬 것은 사후 정렬 원형질의 생존을 향상합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (부여 안돼. DBI 0,519,984)과 국립 보건원 (부여 안돼. 5R01GM078279)에 의해 지원되었다 ...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M stock |
| Eclipse 90i microscope | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M stock |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M stock |
| orbital shaker | Labline Instruments | ||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| conical 15 ml tubes | BD Biosciences | 352196 | |
| table centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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