Summary
一个隔离特定的细胞类型，从植物材料的方法是证明。这种技术采用特定类型的细胞，细胞分离和荧光激活细胞分选表达荧光蛋白的转基因标记线。此外，增长的设置是在这里建立，有利于治疗
Abstract
高分辨率，细胞类型特异性基因表达分析，大大提高了发育调控的理解和在任何多细胞生物体的环境刺激的反应原位杂交和报告基因的可视化，可以在有限的范围内为此目的使用，但对于高分辨率的定量。 RT - PCR或高通量转录全分析特定的细胞类型的RNA分离是必要的。细胞表达一种荧光蛋白标记的组织，在一个特定的细胞类型和随后的荧光激活细胞分选（FACS）的解离，使人们有可能足够数量的材料收集RNA提取，cDNA合成/扩增和基因芯片分析。
一个广泛的细胞类型特异性荧光记者行，是植物研究界。在这种情况下， 拟南芥根的两个标记线：P可控硅：GFP（内皮和静态中心） 和P WOX5：绿色荧光蛋白（静态中心） 。大量的幼苗（千）水培或平板和收获，以获得足够的根材料作进一步的分析。是通过细胞壁的酶消化细胞分解的植物材料。此过程使得使用高渗透压引起质壁分离和市售的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶释放到溶液中的原生质体。
GFP阳性细胞流式细胞仪使用可视化的绿色与红色的发射光谱由488 nm激光激发的原生质体。 GFP阳性的原生质体可以区分增加绿色比红色发射。原生质体是典型的排序直接到RNA的提取液和存储在稍后的时间进一步处理。
这种技术是显示简单和可行的。此外，它表明，它可以毫无困难地使用隔离足够数量的细胞转录组分析的，即使是非常稀少的细胞类型 （如静态的中心细胞）。最后，证明了拟南芥幼苗的生长设置，使无并发症治疗的植物细胞分选前（如生物或非生物的应激反应的细胞类型特异性分析）。讨论可能的补充使用植物原生质体的流式细胞仪。
Protocol
1）植物材料的制备
- 原生质体可来自许多不同的植物物种和组织提供了正确的组合，消化酶的细胞壁是用 1 。之前进行全面的实验，一个小规模的消化的物质，是可取的，以评估protoplasting效率的组织，酶，等，估计％的阳性细胞的细胞分选。在这里，来自拟南芥幼苗根细胞类型特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）是用来的原生质体。内皮和静态中心的标志是：P 可控硅 ：GFP和WOX5由 P的静态中心：绿色荧光 蛋白 2,3（图1） 。
- 水培苗正根长成（0.22％W / V Murashige和Skoog基础培养基[适马]，1％的生长介质，通过它可以让一个尼龙过滤器（250微米网; NITEX）（Sigma公司;图2a）在phytatrays W / V蔗糖，0.05％W / V MES [2 - （N -吗啉）乙磺酸]，用KOH pH值5.7）。此外，植物可以种植尼龙过滤器（100微米网状）（图2b）在垂直位置的1％的琼脂平板上。
- 使用上述过滤器的根的收获，不仅艾滋病，它也有利于秧苗容易额外的治疗，如果需要的话。该过滤器允许幼苗被转移大批新phytatrays或平板辅以利益的催化剂。例如，phytatray设置已用于特定细胞类型的转录响应分析在拟南芥中的氮治疗4。
- 确保显微镜下，你的荧光标记是正确的表达（尤其是当使用的细胞类型特异性标志物的治疗方案，治疗本身可能影响）。在这种情况下，在荧光显微镜下（尼康，图1）幼苗检查。请注意，细胞类型特异性的荧光标记线下共聚焦显微镜，以确定哪些类型的细胞标记，并确定在表达变异的特点应当是最初。
2）准备的protoplasting解决方案
- 解散1.25％W / V纤维素（养乐多），0.3％瓦特/ V Macerozyme（养乐多），0.4 M D -甘露醇，20毫米的MES和20毫米氯化钾软化水（从1米的股票），并调整pH值至5.7 1米的Tris /盐酸pH值7.5。该解决方案将略有浑浊。
- 热的解决方案，到55 ° C 10分钟（该解决方案将转明确），让冷却至室温，加入0.1％前W / V BSA（牛血清白蛋白），10毫米氯化钙 2，5毫米的β-巯基乙醇。
3）收获的植物材料protoplasting
- 根收获刮他们用手术刀的尼龙网眼，并存入一个包含protoplasting解决方案瓶。一般来说，10毫升protoplasting解决方案是每1500幼苗根系。
- 在室温下摇一小时的烧瓶中，轻轻（75 RPM）。潜伏期较长时间可能会增加原生质体的产量，但也将增加protoplasting本身基因表达的影响。
- 过滤器与一个40微米的细胞过滤器（BD猎鹰）原生质体的解决方案和除以15毫升以上锥形管（BD猎鹰）的解决方案。
- 管旋转500克注意10分钟的摆动桶离心机离心速度，这将取决于原生质体使用的类型，它们的脆弱性和酶处理过程中产生的细胞碎片的数量。
- 删除的大部分上清，重悬在余下的解决方案的原生质体，他们用显微镜检查（图3）。
- 一个hemacytometer来估计原生质体的数量和密度。细胞密度将确定进样速度，每秒率的事件，因此，所需的总时间排序在流式细胞仪的细胞（见4.3节）。
- 3.7）要么直接进行流式细胞仪或清洗和重新悬浮在一个潜伏期的解决方案，如W5（154毫米125毫米，5毫米，5毫米的MES氯化钾氯化钙，氯化钠，用KOH调节pH值至5.7）或protoplasting解决方案，没有原生质体添加酶。在转录的变化看，特别是当它的重要性，以尽量减少样品暴露可能会影响基因表达的条件，如改变原生质体，因此，建议保持在protoplasting解决方案的原生质体，并继续保持英寸的缓冲区，尽快以流式细胞仪。
4）荧光激活细胞原生质体排序
- 打开和准备的细胞分选。在这里，FACSAria（BD）是使用。
- 设置一个流流与100＆MU;米喷嘴和20 PSI鞘压力。
- 细胞密度和进样速度可调节的基础上是否一个最好的收益或实现的速度最快需要特定的实验。我们已经成功地排序密度高达千万细胞/ ml。
- 使用流式细胞仪的样本鼓动选项，以防止沉淀的原生质体。如果流式细胞仪堵塞是一个问题，有三种可能的故障排除步骤：1。执行样本行反吹。 2。稀贵的原生质体悬浮，减少密度。 3。清理重复过滤步骤（3.3），离心后和再悬浮原生质体的解决方案。
- 准备的仪器来测量488纳米的激光前向散射（FSC），侧散射（SSC），并在三十〇分之五百三十零nm的绿色荧光蛋白和二十○分之六百一纳米红色自体荧光光谱（RSA）的激发后排放。这些在本质上是用来隔离GFP阳性的原生质体的唯一参数。在这里，电压设置如下：FSC - 60V，250V南南合作，GFP的350V和335V的RSA。需要注意的是最佳的电压设置为每一个流式细胞仪不同的，甚至会需要整个一生的细胞分选调整。
- 开始成立前向散射对侧向散射dotplot。应用，使测量的事件情节为中心的的电压设置。
- 下一步，创建一个绿色与红色荧光信号点图。应用的电压设置，使测量活动产生的情节集中在对角线人口在寻找一个野生型（非GFP）的原生质体悬浮。从GFP标记线的一个原生质体悬浮液会产生明确的人口，野生型样品中从未见过的绿色荧光事件。
- 设置赔偿的限制，调整GFP和RSA之间的光谱重叠。适当的赔偿约束的设置将允许更好地从非- GFP的原生质体和碎片的GFP阳性的原生质体的分离。这里使用的限制如下：RSA，减17.91％的GFP。
- 设置一个门，找出GFP阳性的事件，阴性对照的非- GFP的原生质体应该用来帮助确定门的边界（图4）。
- 为了留下小碎片进行分析，实现向前散射截止。在FSC与SSC的情节可视化的GFP阳性的事件，以帮助确定截止的位置。在这里，截止设置为5000。请注意，流式细胞仪将算作碎片排序活动，并与高层次的碎片样本可能有不同％的GFP比预期的积极事态。这不一定是一个问题。然而，在更多的碎片样本，再排序将采取。
- 根据实验和大量的细胞类型进行分析，流式细胞仪的精度模式设置以获得最佳的收益或最优排序细胞纯度。
- RNA的提取，准备适量的RNA提取缓冲液收集管（1.5 ml离心管）。有了这个设置，20000排序事件将产生一个总体积约100μL，350μL提取缓冲液（微试剂盒，QIAGEN公司的RNeasy）排序。排序完成后，细胞悬液，可在池顶部的混合样本。
- 商店的样品或直接进行RNA提取。成功的微阵列分析已经预制排序从低至500事件中提取的RNA。在这里，我们使用的RNeasy微型提取试剂盒（QIAGEN公司），在WT的Ovation碧RNA扩增系统，FL -的Ovation基因生物素模块V2（NuGEN的）。
代表性的成果
其中约1,500为期一周的老P 可控硅 phytatray：：GFP的幼苗产生约60,000原生质体（hemacytometer测量）。 2.6％65000流式细胞仪处理的事件被定义为GFP阳性和排序（图4b）。
八板约1,500为期四天的老P WOX5：GFP的苗（12000）取得了约3000万原生质体（hemacytometer测量）。 0.063％的1600万流式细胞仪处理的事件被定义为GFP阳性和排序（图4c）。
10,000排序事件通常用于RNA的提取及可产生20至140 ng总RNA（图5）。
图1。在拟南芥根细胞类型特异性的绿色荧光蛋白标记线 。荧光显微镜图像与微分干涉对比（DIC）和GFP的过滤器上的Eclipse 90i显微镜（尼康）在MetaMorph软件（Molecular Devices公司）上运行。 DIC和GFP图像叠加可视化的目的。这种视觉实验中使用这两个标记线;a）芘SCR：：GFP和B）P WOX5：绿色荧光蛋白 。
图2。在环境控制器，在phytatrays（a）或垂直定位的琼脂（二）水，植物生长的条件。幼苗生长。
图3。植物原生质体的表达 GFP荧光显微镜图像与微分干涉对比（DIC）和GFP的过滤器上的Eclipse 90i显微镜（尼康）在MetaMorph软件（Molecular Devices公司）上运行。 DIC和GFP图像叠加可视化的目的。箭头表示爆裂细胞，细胞碎片和一个GFP阳性的原生质体。两个白线之间的距离是50微米。
图4。 GFP阳性的原生质体的荧光激活细胞分选的野生型（A）P可控硅所得的原生质体：：GFP（B）或P WOX5：绿色荧光蛋白（C）标线进行了分析和排序与FACSAria（BD ）利用盖茨定义一个绿色dotplot（三十零分之五百三十○纳米; X轴）与红（二十○分之六百一纳米Y轴）的荧光。在每个小区10万事件。 GFP排序门范围内的事件突出的绿色。
图5。代表10.000排序细胞RNA的提取细胞直接成RNA提取缓冲液（凯杰）排序，RNA纯化，并在2100生物分析仪（安捷伦）的浓度，纯度和完整性检查。三个重复标记线显示为。
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Discussion
原生质体，原则上可以来自多种植物组织，优化了有利条件，将大大提高RNA的质量和数量。 protoplasting解决方案和选修孵化缓冲会影响这方面的问题。
许多不同的荧光蛋白可以使用，这取决于所用流式细胞仪的功能，如GFP，RFP，YFP，CFP资格或他们的许多变种及衍生工具。标志物的表达不只是可以驱动细胞类型特异性启动子或增强子陷阱，如下所示，但也由你最喜欢的发起人，如反应合成的一种激素记者基因 5 。植物原生质体的双色流式细胞仪也是可行的。 ，例如，这可以被用于执行一个短暂的改造实验，使用一种荧光阳性选择标记 5的向量时。
原生质体，也可以为基因组DNA，蛋白质或代谢物6进行分析排序。保持活着排序后的原生质体是具有挑战性的，由于其脆弱性，使用较大的（130微米）的喷嘴和鞘压力较低，并整理成一个优化的孵化缓冲区将增强排序后的原生质体的可行性。
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Acknowledgments
这项工作是支持由美国国家科学基金会（授予没有。DBI 0519984）和美国国立卫生研究院（赠款。5R01GM078279）..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M stock |
| Eclipse 90i microscope | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M stock |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M stock |
| orbital shaker | Labline Instruments | ||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| conical 15 ml tubes | BD Biosciences | 352196 | |
| table centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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