Summary
Sinapses glutamatérgicas pode mudar de um modo ativo de um modo silencioso. Nós demonstramos que o status de atividade pré-sináptica da cultura dissociada dos neurônios dos roedores é visualizado através de um formulário fixable do FM1-43 corante para visualizar sinapses ativas e imunocoloração com vGluT-1 anticorpos para visualizar todas as sinapses de glutamato.
Abstract
Synaptic subjaz plasticidade provável capacidade do sistema nervoso de aprender e lembrar e também pode representar uma capacidade de adaptação que impede que outra forma de tornar-se prejudicial insultos neurotóxicos. Temos vindo a estudar uma forma de plasticidade pré-sináptico que é interessante em parte porque ele é expresso como uma comutação digital dentro e fora da capacidade de um terminal pré-sináptico s para liberar vesículas contendo o neurotransmissor glutamato. Aqui demonstramos um protocolo para a visualização do status da atividade de terminais pré-sinápticos em culturas de células dissociadas preparadas do hipocampo de roedores. O método baseia-se na detecção de sinapses ativas usando coloração com uma forma fixable do corante styryl FM1-43, comumente usado para rotular vesículas sinápticas. Este perfil coloração é comparado com imunomarcação dos terminais mesmo com um anticorpo dirigido contra o transportador de glutamato vesicular 1 (vGluT-1), uma mancha projetado para rotular todas as sinapses de glutamato, independentemente do status da ativação. Nós encontramos que os estímulos despolarizantes induzir silenciamento pré-sináptica. A população de sinapses que é silencioso em condições de linha de base pode ser ativado por silenciar elétrica prolongada ou por ativação de vias de sinalização cAMP.
Protocol
Preparação cultura
- Prepare culturas de células dissociadas de ratazana ou rato de células do hipocampo dia pós-natal 0-3 animais 1. Nossos neurônios aderir a uma monocamada subjacente astrócitos, que por sua vez, adere a uma camada de colágeno espalhados em uma lamela espessura número 0. Placa de neurônios a uma densidade de cerca de 500 células por centímetro quadrado.
- Permitir que as culturas a crescer por 10-14 dias para permitir o desenvolvimento e maturação sináptica. Tratam as culturas in vitro no dia 4 com a ARAC antimitóticos para prender um maior crescimento glial. Alimentá-los no dia 5 in vitro com um câmbio médio metade com médias mais Neurobasal B27 suplemento para aumentar a sobrevivência neuronal.
- Durante o período de cultivo, introduzir tratamentos destinados a alterar o número de sinapses funcionalmente silenciada. Nós achamos que uma forma conveniente para silenciar uma grande porcentagem (~ 80%) das sinapses glutamato é um tratamento de 4 horas com 30 mM de potássio. Incubações mais fraco com estímulos despolarizantes induzir silenciamento 2 similar. Estímulo de 4 horas com 50 mM forskolin, um ativador da adenilato ciclase, pode ser usado para despertar a população de terminais de silêncio no início do estudo 3.
Visualizando sinapses silenciosas
- Células deve ter uma densidade relativamente baixa, com processos bem separados neuríticas no dia 14/10 in vitro, de modo a facilitar a visualização dos terminais sinápticos discretos usando microscopia de fluorescência.
- Prepare uma solução estoque de 5 mM FM1-43FX em água destilada. O estoque deve ser mantido no escuro a 4 ° C. Todos os experimentos usando FM1-43FX também deve ser realizado no escuro.
- Desafio das culturas por 2 minutos com 45 mM de cloreto de potássio em uma solução HEPES-salina tamponada contendo 100 mM de cloreto de sódio, cloreto de cálcio 2 mM, 1 mM de cloreto de magnésio, 10 mM de glicose, e 10 mM FM1-43FX. Esta solução também deve conter uma mM e 25 mM NBQX D-APV para bloquear os receptores pós-sinápticos e evitar sinalização recorrentes. Este desafio vai rótulo terminais sinápticos que são capazes de exocitose e endocitose. O tempo de desafio e força são concebidos para causar pelo menos uma rodada de exocitose de vesículas todos os disponíveis nos 4 piscina reciclagem. No entanto, o desafio não é suficiente para causar silenciar adicional de terminais.
- Lavar a cultura para 3 a 5 segundos apenas, usando o mesmo HEPES-salina tamponada sem cloreto de potássio, mas com 500 mM Advasep-7 para remover a tintura inespecífica 5. Note-se que o timing desta etapa é crítica como a aplicação prolongada de Advasep-7 irá resultar na perda de todos rotulagem FM1-43FX. Próxima lavagem em HEPES-salina tamponada sem Advasep-7 durante cinco intervalos de 2 minutos.
- Fix células com paraformaldeído 4% e glutaraldeído 0,2% em PBS, pH 7,4 por 10 minutos. Lave as células, uma vez brevemente com PBS, em seguida, incubar por 15 minutos em solução de bloqueio contendo soro de cabra normal e 4% 0,04% Triton X-100 em PBS. Note-se que FM1-43FX também é muito sensível à quantidade de Triton X-100 usados aqui e em etapas posteriores. De modo geral, FM1-43FX rotulagem é melhor na ausência de qualquer Triton X-100, mas um pouco de detergente é necessário para permeabilizar as células para a imunocoloração subseqüentes. Temos determinada empiricamente que 0,04% Triton X-100 é ideal para exame pré-sináptico das sinapses silenciosas.
- Diluir o anticorpo primário vGluT-1 em solução de bloqueio em uma concentração de 1:2.500. Incubar as células com agitação suave / rotação no diluída vGluT-1 anticorpo por 3 horas à temperatura ambiente. Certifique-se de cobrir pratos sua cultura com papel alumínio para evitar o branqueamento do corante FM1-43FX.
- Lave as células duas vezes em PBS e incubar as células com um anticorpo anti-porco guinea conjugado a um fluoróforo com diferentes características espectrais de FM1-43FX para distinguir as duas manchas. Para nosso experimento, usaremos Alexa 555-conjugados de anticorpos anti porco guinea-a 1:500 em solução de bloqueio. Incubar as células com o anticorpo secundário agitando por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Lave as células quatro vezes mais em PBS e depois montar a lamínula sobre uma lâmina de vidro com uma pequena gota de Fluoromount-G. Certifique-se de orientar a lamela para que as células enfrentar o slide. Permitir que os slides para secar durante a noite.
- Agora estamos prontos para adquirir imagens das sinapses ativas e inativas. Prepare um objetivo de óleo 60 x 1,4 com uma abertura numérica em um microscópio confocal de varredura a laser. Coloque um slide no palco, garantindo que o lado lamela está voltada para o objetivo. Depois de focar o slide, encontrar um campo de neurites que não é muito densa. Também é recomendado para evitar a imagem perto da soma das células, como corante FM1-43FX residual pode permanecer lá, mesmo após a lavagem extensiva. Para as nossas imagens experimental, que normalmente ampliar um campo de tamanho 51 51 microns.
- Adquirirz uma pilha de um determinado campo cobrindo uma profundidade de 7,8 microns com 27 0,3 micron-passos. Esta gama é suficiente para cobrir a espessura das neurites na nossa cultura. Para cada passo na z-stack, primeiro exame com a luz laser que excita imunofluorescência do vGluT-1 anticorpos para identificar todas as sinapses glutamatérgicas em um campo do microscópio. Mesmo campo será verificado novamente a cada passo para FM1-43FX fluorescência. Definir a filtragem de densidade neutra e ganhos fotomultiplicador consistente entre todos os lamínulas para um dado experimento, evitando a saturação do sinal. Que normalmente adquirem ≥ 5 campos por condição para cada experimento.
- Usando o software de análise, converter o z-stack em uma imagem de plano único composto. O processo que usamos para essa conversão produz uma imagem com base na intensidade máxima de qualquer plano em cada pixel. A imagem composta é thresholded e vGluT-1 terminais são identificados para análise, sem referência à FM1-43FX mancha. Áreas manchadas, referido como puncta, são marcados como regiões de interesse. Normalmente, selecionar 10 puncta por campo. Em seguida, o canal de FM1-43FX é thresholded e as regiões de interesse são sobrepostos. O software de análise é utilizada para quantificar a intensidade de fluorescência de cada sinal, bem como a área de cada punctum. Um critério absoluto de pixels ou um percentual de pixels critério pode ser usado para distinguir ativos de sinapses inativas.
Resultados representante
- Em nossas culturas, descobrimos que 70-80% das sinapses glutamato, definida por vGluT-1 coloração, apresentam detectáveis FM1-43 coloração 2, 6-8. Em imagens sobrepostas de verde FM1-43 fluorescência e vermelho vGluT-1 coloração isso se reflete como uma abundância de puncta amarelo: sinapses com co-localizada marcadores. Estas são indicadas pelas setas.
- Aproximadamente 20-30% de (vermelho) vGluT-1 puncta positivo deixará de ter (verde) FM1-43 fluorescência acima dos valores basais. Estes são os terminais inativos pré-sináptica, e um exemplo é indicado pela seta.
- A terceira população de sinapses também será observado. Estes são positivas para (verde) FM1-43 fluorescência, mas desprovido de (vermelho) coloração vGluT-1. Estes são ativos sinapses GABAérgicos e um exemplo é indicado pelo asterisco. Estes são excluídos da maioria das nossas análises, mas pode ser explicitamente estudada usando um anticorpo transportador vesicular GABA no lugar do vGluT-1 anticorpos.
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Discussion
Significado
- Normalmente as sinapses são pensadas para operar liberando transmissor com uma probabilidade mensurável. Trabalho por nós e os outros torna evidente que algumas sinapses são refratários à liberação de neurotransmissores, apesar de um conjunto completo do transportador do neurotransmissor vesicular e de outros importantes marcadores pré-sináptica 2, 6-8. Nós temos mostrado previamente que a atividade de rede basal em neurônios é fundamental para manter essa população de sinapses inativas.
Etapas críticas
- Inclusão de uma lavagem rápida com 500 mM Advasep-7 aumenta significativamente a qualidade de FM1-43FX coloração. No entanto, mesmo um ligeiro aumento no tempo desta lavar mais de 5 segundos irá resultar na perda de FM1-43FX rotulagem.
- FM1-43FX é muito sensível à quantidade de Triton X-100 utilizada na porção imunocoloração do protocolo. FM1-43FX rotulagem é melhor na ausência de qualquer Triton X-100, mas um pouco de detergente é necessário para permeabilizar as células para vGluT-1 imunocoloração. Temos determinada empiricamente que 0,4% Triton X-100 é ideal para exame pré-sináptico das sinapses silenciosas.
Modificações
- Pode-se usar um marcador pós-sinápticos como 3 ª mancha para garantir vGluT-1 representa coloração bona fide sinapses: pontos de contato entre vesículas carregadas de cachos terminais e receptor pós-sináptico.
- Pode-se também optar por utilizar outros marcadores de anticorpos pré-sináptico, como o marcador pan-sináptica, SV2, ou vGAT.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede DA018109 e MH78823 e Neuroscience NIH Grant Blueprint Núcleo P30NS057105 para Washington University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
