Summary
Glutamaterg synapser kan växla från aktivt läge till ett tyst läge. Vi visar att presynaptiska aktiviteten status i dissocierade kultur av gnagare nervceller visualiseras med hjälp av en fastställbara form av FM1-43 dye att visualisera aktiva synapser och immunfärgning med vGluT-1-antikroppar för att visualisera alla glutamat synapser.
Abstract
Synaptisk plasticitet sannolikt ligger bakom nervsystemets förmåga att lära och minnas och kan också representera en anpassningsförmåga som förhindrar annars skada förolämpningar från att bli neurotoxiska. Vi har studerat en form av presynaptisk plasticitet som är intressant dels därför att det är uttryckt som en digital och frånkoppling av en presynaptisk terminal förmåga att släppa vesikler som innehåller signalsubstansen glutamat. Här visar vi ett protokoll för att visualisera aktiviteten status presynaptiska terminaler i dissocierade cellkulturer framställda av gnagare hippocampus. Metoden bygger på att upptäcka aktiva synapser med färgning med en fastställbara form av styryl färgämnet FM1-43, som vanligen används för att märka synaptiska blåsor. Denna färgning profilen jämförs med immunfärgning av samma terminaler med en antikropp riktad mot vesikulär glutamat transportör 1 (vGluT-1), en fläck för att märka alla glutamat synapser oavsett aktiveringsstatus. Vi finner att depolariserande stimuli framkalla presynaptiska tysta. Befolkningen i synapser som är tyst enligt huvudscenariot kan aktiveras vid långvarig elektriska tysta eller genom aktivering av cAMP signalvägar.
Protocol
Kultur förberedelse
- Förbered dissocierade cellkulturer av råtta eller mus hippocampus celler från postnatal dag 0 till 3 djur 1. Vår nervceller följer ett underliggande astrocyternas cellslager, vilket i sin tur följer en kollagen lager utspridda på ett antal 0 tjocklek täckglas. Tavla av nervceller vid en densitet av ca 500 celler per kvadratcentimeter.
- Låt kulturerna att växa i 10-14 dagar för att möjliggöra synaptiska utveckling och mognad. Behandla kulturer på dagen för in vitro-4 med Mitoshämmande Arac att gripa ytterligare glial tillväxt. Mata dem på dagen för in vitro-5 med en halv medelstora utbyte med Neurobasal medelstora plus B27 tillägg för att förbättra neuronal överlevnad.
- Under kultur perioden, införa behandlingar som syftar till att ändra antalet funktionellt tystas synapser. Vi finner att ett bekvämt sätt att tysta en stor andel (~ 80%) av glutamat synapser är en 4-timmars behandling med 30 mm kalium. Längre inkubationer med svagare depolariserande stimuli framkalla liknande tysta 2. 4-timmars stimulering med 50 mikroM Det ha, en aktivator av adenylyl cyclases, kan användas för att väcka befolkningen i tysta terminaler vid baslinjen 3.
Visualisering tysta synapser
- Celler bör ha en relativt låg densitet med väl separerade neuritic processer på dagen för in vitro 10-14 för att underlätta visualisering av diskreta synaptiska terminaler med hjälp av fluorescensmikroskopi.
- Bered en stamlösning av 5 mM FM1-43FX i destillerat vatten. Beståndet bör bibehållas i mörker vid 4 ° C. Alla försök med FM1-43FX bör också genomföras i mörker.
- Utmana de kulturer i 2 minuter med 45 mm kaliumklorid i en HEPES-buffrad saltlösning innehållande 100 klorid mM natriumklorid, 2 mm kalciumklorid, 1 mM magnesiumklorid, 10 mm glukos, och 10 mikroM FM1-43FX. Denna lösning bör också innehålla en mikroM NBQX och 25 mikroM D-APV att blockera postsynaptiska receptorer och förebygga återkommande signalering. Denna utmaning kommer etiketten synaptiska terminaler som kan exocytos och endocytos. Utmaningen tid och kraft är utformade för att orsaka åtminstone en runda av exocytos av alla tillgängliga blåsor på återvinning poolen 4. Men den utmaningen inte tillräckligt för att orsaka ytterligare tysta terminaler.
- Tvätta kultur i 3 till 5 sekunder, med samma HEPES-buffrad koksaltlösning utan kaliumklorid, men med 500 mikroM Advasep-7 för att ta bort icke-specifik färgning 5. Observera att tidpunkten för detta steg är viktigt eftersom långvarig tillämpning av Advasep-7 kommer att resultera i förlust av alla FM1-43FX märkning. Därefter tvättas i HEPES-buffrad koksaltlösning utan Advasep-7 för fem 2-minuters intervaller.
- Fix celler med 4% paraformaldehyd och 0,2% glutaraldehyd i PBS, pH 7,4 i 10 minuter. Tvätta cellerna gång försiktigt med PBS, sedan Inkubera i 15 minuter i blockerande lösningen innehåller 4% normala get serum och 0,04% Triton X-100 i PBS. Observera att FM1-43FX är också mycket känslig för mängden Triton X-100 som används här och i senare steg. Generellt sett är FM1-43FX märkning bäst i avsaknad av Triton X-100, men en del tvättmedel är nödvändigt att permeabilize celler för senare immunfärgning. Vi har fastställt empiriskt att 0,04% Triton X-100 är optimal för undersökning av presynaptically tysta synapser.
- Späd den primära vGluT-1-antikropp i blockerande lösningen vid en koncentration av 1:2500. Inkubera cellerna med försiktig skakning / rotation i de utspädda vGluT-1-antikroppar under 3 timmar vid rumstemperatur. Var noga med att täcka din kultur rätter med folie för att förhindra blekning av FM1-43FX färgämne.
- Tvätta cellerna två gånger i PBS och inkubera celler med en anti-marsvin antikropp konjugerad med ett fluoroforen med olika spektrala egenskaper från FM1-43FX att skilja de två fläckar. För vårt experiment kommer vi att använda Alexa 555-konjugerat anti-marsvin antikroppar vid 1:500 i blockerande lösningen. Inkubera cellerna med den sekundära antikroppen under omskakning i 30 minuter i rumstemperatur.
- Tvätta cellerna fyra gånger i PBS och sedan montera locket glida på en glasplatta med en liten droppe Fluoromount-G. Var noga med att orientera täckglas så att cellerna ansikte i bilden. Låt objektglasen torka över natten.
- Vi är nu redo att köpa bilder av aktiva och inaktiva synapser. Förbered en 60 x olja mål med en 1,4 numerisk bländare på en konfokala laserskanning mikroskop. Placera en bild på scenen, se till att täckglaset är vänd målet. Efter att fokusera på bilden, hitta ett område neurites som inte är alltför tät. Det rekommenderas också att undvika avbildning nära cellen soma, som restbelopp FM1-43FX färg kan stanna kvar där även efter omfattande tvätt. För vår experimentella bilder, zooma vi vanligen i ett fält storlek 51 51 mikrometer.
- Förvärvaen z-stack för ett givet område som täcker ett djup av 7,8 mikrometer med 27 0,3-micron steg. Detta intervall är tillräckligt för att täcka tjocklek neurites i vår kultur. För varje steg i z-stack, skanna först med laserljus som väcker immunofluorescens av vGluT-1-antikroppar för att identifiera alla glutamaterg synapser i mikroskop fält. Samma område på nytt skannas på varje steg för FM1-43FX fluorescens. Ställ neutral densitet filtrering och vinster fotomultiplikatorn genomgående bland alla täckglas för ett visst experiment och samtidigt undvika mättnad av signalen. Vi förvärvar vanligen ≥ 5 fält per tillstånd för varje experiment.
- Använda analys programvara, omvandlar z-stack in i en sammansatt enda plan bild. Den process vi använder för denna omvandling ger en bild baserad på den högsta nivån från någon plan på varje pixel. Den sammansatta bilden thresholded och vGluT-1 terminaler identifieras för analys, utan hänvisning till FM1-43FX fläcken. Missfärgade områden, så kallade puncta är markerade som områden av intresse. Vi väljer vanligtvis 10 puncta per fält. Nästa FM1-43FX kanal thresholded och regioner av intresse är överlagrade. Analysen programvara används för att kvantifiera fluorescensintensiteten för varje signal samt området i varje punctum. En absolut pixel kriterium eller en procentsats pixel kriterium kan användas för att skilja aktiv från inaktiva synapser.
Representativa resultat
- I våra kulturer, finner vi att 70-80% av glutamat synapser, som definieras av vGluT-1 färgning, uppvisar detekterbara FM1-43 färgning 2, 6-8. I överdrog bilder av gröna FM1-43 fluorescens och röda vGluT-1 färgning detta återspeglas ett överflöd av gult puncta: synapser med co-lokaliserade markörer. Dessa indikeras av pilarna.
- Ungefär 20-30% av (röd) vGluT-1-positiva puncta inte kommer att ha (grön) FM1-43 fluorescens över baslinjen. Dessa är de inaktiva presynaptiska terminalerna, och ett exempel visas med pilspetsen.
- En tredje befolkning synapser kommer också att beaktas. Detta är positivt för (grön) FM1-43 fluorescens men saknar (röd) vGluT-1 färgning. Dessa är aktiva GABAergic synapser och ett exempel är markerad med en asterisk. Dessa är undantagna från de flesta av våra analyser, men kan vara explicit studeras med hjälp av en vesikulär GABA transportör antikroppar i stället för vGluT-1-antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelse
- Normalt synapser tros verka genom att släppa sändare med en mätbar sannolikhet. Verk av oss själva och andra gör det uppenbart att vissa synapser är terapiresistenta släppa signalsubstans, trots en full uppsättning av vesikulär neurotransmittor transportörer och andra centrala presynaptiska markörer 2, 6-8. Vi har visat tidigare att de basala nätet aktiviteten i nervceller är avgörande för att upprätthålla denna population av inaktiva synapser.
Kritiska steg
- Införande av en kort tvätt med 500 mikroM Advasep-7 förbättrar avsevärt kvaliteten på FM1-43FX färgning. Kommer dock även en viss ökning av tidpunkten för detta skölja över 5 sekunder resultera i förlust av FM1-43FX märkning.
- FM1-43FX är mycket känslig för mängden Triton X-100 som används i immunfärgning del av protokollet. FM1-43FX märkning är bäst i avsaknad av Triton X-100, men en del tvättmedel är nödvändigt att permeabilize celler för vGluT-1 immunfärgning. Vi har fastställt empiriskt att 0,4% Triton X-100 är optimal för undersökning av presynaptically tysta synapser.
Ändringar
- Man kan använda en postsynaptiska markör som en 3: e fläck för att säkerställa vGluT-1 färgning representerar bona fide synapser: beröringspunkter mellan vesikler-lastad terminaler och postsynaptisk kluster receptorn.
- Man kan också välja att använda andra presynaptiska antikroppar markörer som den pan-synaptiska markör, SV2 eller vGAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag DA018109 och MH78823 och NIH neurovetenskap Blueprint Kärna Grant P30NS057105 till Washington University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
