Summary
Glutamaterjik sinaps sessiz mod aktif bir moda geçiş yapabilirsiniz. Biz kemirgen nöronların ayrışmış kültür bu presinaptik aktivite durumu gösteren aktif sinaps görselleştirmek için FM1-43 boya tamir edilebilir formu kullanarak ve tüm glutamat sinaps görselleştirmek için vGluT-1 antikoru ile immün görüntülenmiştir.
Abstract
Sinaptik plastisite olasılığı altında yatan sinir sistemi yeteneğini öğrenmek ve hatırlamak ve nörotoksik olma, aksi takdirde zarar hakaret engelleyen bir adaptasyon temsil edebilir. Nörotransmitter glutamat içeren veziküller serbest bırakmak için bir presinaptik terminal yeteneği bir dijital anahtarlama ve kapalı olarak ifade edilir, çünkü kısmen ilginç presinaptik plastisite bir form eğitim görüyor. Burada kemirgen hipokampus hazırlanan ayrışmış hücre kültürlerinde presinaptik terminalleri faaliyet durumu görselleştirmek için bir protokol göstermektedir. Bu yöntem yaygın olarak sinaptik veziküller etiketlemek için kullanılan styryl boya tamir edilebilir formu FM1-43 ile boyanma kullanarak aktif sinaps tespit dayanmaktadır. Bu boyama profili veziküler glutamat taşıyıcısı 1 (vGluT-1), glutamat sinaps aktivasyon durumu ne olursa olsun, etiket için tasarlanmış leke yöneltilen bir antikor ile aynı terminalleri İmmünoboyama ile karşılaştırılır. Biz depolarizan uyaranlara presinaptik susturulması neden olduğunu bulmak. Bazal koşullar altında sessiz sinaps nüfusu uzun süreli elektrik susturulması veya cAMP sinyalizasyon yollarının aktivasyonu ile aktive edilebilir.
Protocol
Kültür hazırlık
- Postnatal 0 ila 3 gün hayvanlar 1 sıçan veya fare hipokampal hücrelerinin ayrışmış hücre kültürleri hazırlayın. Bizim nöron sayısı 0 kalınlığı lamel üzerine yayılmış bir kollajen tabakası yapışır açmak altta yatan bir astrosit tek tabaka, uymak. Santimetre kare başına yaklaşık 500 hücre yoğunluğu nöron Plaka.
- Kültürlerin sinaptik gelişme ve olgunlaşma izin 10-14 gün boyunca büyümeye izin verin. Daha glial büyüme tutuklama antimitotic AraC ile in vitro 4 gün kültürleri davranın. Nöronal yaşam geliştirmek için Neurobasal orta artı B27 takviyesi ile bir buçuk orta alışverişi ile in vitro 5 gün onları besleyin.
- Kültür dönemde, işlevsel susturuldu sinaps sayısı değiştirmek için tasarlanmış tedaviler tanıtmak. Biz 30 mM potasyum ile 4 saatlik bir tedavi glutamat sinaps (~% 80) büyük bir yüzdesini susturmak için tek uygun yol olduğunu bulabilirsiniz. Zayıf depolarizan uyaranlara ile uzun inkubasyon benzer susturulması 2 neden olur. 50 mcM forskolin, adenilat cyclases bir aktivatör, 4 saat stimülasyon bazal 3 sessiz terminalleri nüfus uyandırmak için kullanılabilir.
Sessiz sinaps görselleştirme
- Hücreler floresan mikroskopi kullanılarak kesikli sinaptik terminalleri görselleştirme kolaylaştırmak amacıyla in vitro 10-14 gün iyi ayrılmış nöritik süreçleri ile nispeten düşük yoğunluklu olmalıdır.
- Distile su ile 5 mM FM1-43FX bir stok solüsyonu hazırlayın. Hisse senedi, 4 karanlıkta muhafaza edilmelidir ° C FM1-43FX kullanan tüm deneyleri de karanlıkta yapılmalıdır.
- 45 mM potasyum klorür, 100 mM sodyum klorür, 2 mM kalsiyum klorür, 1 mM magnezyum klorür, 10 mM glukoz ve 10 mcM FM1-43FX içeren bir Hepes-tamponlu salin solüsyonu ile 2 dakika boyunca kültürlerin meydan. Bu çözüm aynı zamanda, postsinaptik reseptörleri bloke ve tekrarlayan sinyal önlemek için 1 mcM NBQX ve 25 mcM D-APV içermelidir. Bu meydan okuma, endositoz ekzositoz ve yeteneğine sahiptir sinaptik terminalleri etiket. Meydan okuma zamanı ve gücü, mevcut tüm geri dönüşüm havuz 4 veziküllerin ekzositoz en azından bir tur neden tasarlanmıştır . Ancak, meydan okuma terminalleri ek susturulması için yeterli bir sebep değildir.
- Potasyum klorür olmadan tuzlu Hepes-tamponlu, ancak 500 mcM ile Advasep-7 nonspesifik boya 5 kaldırmak için aynı yöntem kullanılarak, sadece 3 - 5 saniye boyunca kültür yıkayın . Bu adımın zamanlaması tüm FM1-43FX etiketleme kaybına neden olacaktır Advasep-7 uzun süreli uygulama gibi kritik olduğunu unutmayın. Sonraki yıkama beş, 2 dakikalık aralıklarla Advasep-7 olmadan tuzlu Hepes tamponlu.
- 10 dakika PBS, pH 7.4,% 4 paraformaldehid ve% 0.2 glutaraldehid hücreleri saptamak. Bir kez kısaca hücreler PBS ile yıkayın, daha sonra, PBS içinde% 4 normal keçi serumu ve% 0.04 Triton X-100 içeren engelleme çözümü 15 dakika süreyle kuluçkaya yatmaktadır. FM1-43FX Triton X-100 ve sonraki adımları kullanılan miktarı çok hassas olduğunu unutmayın. Genel olarak konuşursak, FM1-43FX etiketleme herhangi bir Triton X-100 yokluğunda iyi, ancak bazı deterjan sonraki immün hücreler permeabilize için gereklidir. Biz 0.04% Triton X-100 presynaptically sessiz sinaps muayene için en uygun olduğunu ampirik olarak tespit ettik.
- 1:2500 'lik bir konsantrasyon çözüm engelleme birincil vGluT-1 antikor sulandırınız. Hücreleri, oda sıcaklığında 3 saat süreyle seyreltilmiş vGluT-1 antikor hafif sallayarak / devir ile inkübe edin. FM1-43FX boya kasar önlemek için folyo ile kültür kaplarına karşılamak için emin olun.
- Hücreler PBS içinde iki kez yıkayın ve sonra hücrelerin iki lekeleri ayırt etmek için bir fluorofor FM1-43FX farklı spektral özelliklere sahip bir anti-kobay konjuge antikor ile inkübe edin. Deneme için, biz çözüm engelleme 1:500 555-konjuge anti-kobay antikor Alexa kullanacaktır. Oda sıcaklığında 30 dakika sallayarak hücreleri ikincil antikor ile inkübe edin.
- Hücreler PBS içinde dört kez daha yıkayın ve ardından küçük bir damla Fluoromount-G kullanarak bir bardak slayt üzerindeki kapağı kayma monte. Hücreler slayt bakacak şekilde yönlendirmek lamel emin olun. Slaytları gecede kurumasını bekleyin.
- Şu anda aktif ve pasif sinaps görüntüler elde etmek için hazırız. Konfokal lazer tarama mikroskobu 1.4 sayısal diyafram ile 60 x yağlı objektif hazırlayın. Lamel yan amacı ile karşı karşıya olduğunu sağlanması, sahnede bir slayt yerleştirin. Slayt odaklanarak sonra, aşırı yoğun değildir neurites bir alan bulabilirsiniz. Artık FM1 43FX boya geniş yıkamadan sonra bile orada kalırlar Ayrıca, hücre soma yakın görüntüleme önlemek için tavsiye edilir. Deneysel görüntüler için, biz genellikle bir alan boyutu 51 51 mikron yakınlaştırmak.
- Kazanmakbelirli bir alanda, 27 0.3 mikron adımları ile 7.8 mikron derinliğe kapsayan bir z-yığını. Bu aralık, bizim kültürümüzde neurites kalınlığı karşılamak için yeterli olacaktır. Z-yığını her adım için, bir mikroskop alanında tüm glutamaterjik sinaps tanımlamak için vGluT-1 antikoru immünofloresan heyecanlandıran lazer ışığı ile tarayın. FM1-43FX floresan her adım için aynı alanda yeniden taranır. Doygunluk sinyali kaçınarak, belirli bir deney için tüm lamelleri arasında sürekli olarak nötr yoğunluk filtreleme ve photomultiplier kazanımlar ayarlayın. Biz genellikle her bir deney için ≥ durum ortalama 5 alan kazanır.
- Kompozit bir tek düzlem görüntü analiz yazılımı kullanarak, z-yığın dönüştürmek. Bu dönüşüm için kullanılan işlem, her bir piksel herhangi bir uçaktan maksimum yoğunluğuna göre bir görüntü üretir. Kompozit görüntü eşiklenir ve vGluT-1 terminalleri FM1-43FX referans leke olmadan, analiz için tanımlanır. Puncta olarak anılacaktır Vitray alanları, ilgi çekici bölge olarak işaretlenmiştir. Biz genellikle alan başına 10 puncta seçin. Sonraki FM1-43FX kanal eşiklenir ve ilgi bölgeleri üst üste. Analiz yazılımı, her bir sinyalin floresan yoğunluğunun yanı sıra, her punktum alanda ölçmek için kullanılır. Inaktif sinapsların aktif ayırt etmek için, mutlak bir piksel kriter ya da bir yüzdesi piksel kriter kullanılabilir.
Temsilcisi Sonuçlar
- Bizim kültürde, biz vGluT-1 boyanmasının tarafından tanımlanan glutamat sinaps% 70-80, saptanabilir FM1-43 boyama 2, 6-8 sergilediğimiz bulabilirsiniz. Ile kaplanan görüntülerde FM1-43 yeşil floresan ve kırmızı vGluT-1 sarı puncta bir zenginliği olarak yansır boyama co-lokalize işaretleri ile sinaps. Bu oklarla gösterilir.
- Yaklaşık% 20-30 (kırmızı) vGluT-1 pozitif puncta bazal yukarıda (yeşil) FM1-43 floresan başarısız olur. Bu inaktif presinaptik terminaller ve örnek bir ok ucu ile gösterilir.
- Sinaps üçüncü bir nüfusun da görülecektir. Bunlar pozitif (yeşil) FM1-43 (kırmızı) vGluT-1 boyama floresan ama yoksun. Bu aktif GABAerjik sinaps ve örnek bir yıldız işareti ile gösterilir. Bu analizlerin dışında ama açıkça vGluT-1 antikor yer veziküler GABA taşıyıcı antikor kullanılarak incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önem
- Tipik olarak ölçülebilir bir olasılık verici serbest sinapsların çalıştırmak için düşünülmektedir. Veziküler nörotransmitter taşıyıcı ve diğer önemli presinaptik belirteçlerinin 2, 6-8, kendimiz ve başkaları tarafından tam rağmen, bazı sinaps nörotransmitter serbest dirençli olduğu aşikar kılar . Biz nöronlar bazal ağ aktivite inaktif sinaps bu nüfusu korumak için kritik olduğunu daha önce göstermiştir.
Kritik adımlar
- 500 mcM Advasep-7 ile kısa bir yıkama dahil edilmesi FM1 43FX boyama kalitesini önemli ölçüde artırır. Ancak, bu yıkama zamanlama 5 saniye içinde bile hafif bir artış FM1-43FX etiketleme kaybına neden olacaktır.
- FM1-43FX Triton X-100 protokol immün kısmında kullanılan miktarı çok hassas. FM1-43FX etiketleme herhangi bir Triton X-100 yokluğunda iyi, ama bazı deterjan vGluT-1 immün hücreler permeabilize için gereklidir. % 0.4 Triton X-100 presynaptically sessiz sinaps muayene için en uygun olduğunu ampirik olarak tespit ettik.
Değişiklikler
- 3. bir leke olarak vGluT-1 boyanmasının sağlamak için iyi niyetli sinaps temsil biri postsinaptik işaretleyici kullanabilirsiniz: vezikül yüklü terminaller ve postsinaptik reseptör kümeleri arasındaki temas noktaları.
- Bir de Pan-sinaptik marker, SV2 olduğunda, ya da vGAT gibi diğer presinaptik antikor işaretleri kullanmak için seçebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Washington Üniversitesi NIH hibe DA018109 ve MH78823 ve NIH Nörobilim Blueprint Core Hibe P30NS057105 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
