Summary
Glutamatergen Synapsen kann von einem aktiven Modus, um einen Silent-Modus wechseln. Wir zeigen, dass präsynaptische Aktivität Status in dissoziierten Kultur der Nager Neuronen visualisiert mit einem fixierbaren Form des FM1-43 Farbstoff aktiven Synapsen visualisieren und Immunfärbung mit vGluT-1-Antikörper, um alle Glutamat Synapsen zu visualisieren.
Abstract
Synaptische Plastizität wahrscheinlich liegt dem Nervensystem die Fähigkeit zu lernen und zu erinnern und auch stellen eine Anpassungsfähigkeit, die sonst verhindert eine Beschädigung Beleidigungen zu neurotoxischen. Wir haben das Studium eine Form der präsynaptischen Plastizität, die interessante Teil ist, weil es als digitale Ein-und Ausschalten eines präsynaptischen Terminal s Fähigkeit, Vesikel mit dem Neurotransmitter Glutamat-Ausschüttung zum Ausdruck kommt. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Visualisierung der Aktivität Status der präsynaptischen in dissoziierten Zellkulturen aus dem Hippocampus Nagetier vorbereitet. Die Methode beruht auf der Erfassung aktiven Synapsen mit Färbung mit einem fixierbaren Form der Styryl-Farbstoff FM1-43, häufig verwendet, um synaptische Vesikel-Label. Diese Färbung Profil ist mit Immunfärbung des gleichen Terminals mit einem Antikörper gegen den vesikulären Glutamat-Transporter 1 (vGluT-1), eine Kennzeichnungspflicht aller Glutamat Synapsen unabhängig von Aktivierungsstatus konzipiert Fleck gerichtet verglichen. Wir finden, dass depolarisierende Stimuli präsynaptischen Schweigen zu induzieren. Die Bevölkerung von Synapsen, die still ist unter Baseline-Bedingungen können bei längerer elektrischen Schweigen oder durch Aktivierung des cAMP-Signalwege aktiviert werden.
Protocol
Kultur Vorbereitung
- Bereiten dissoziierten Zellkulturen von Ratte oder Maus Hippocampus-Zellen aus postnatalen Tag 0 bis 3 Tiere 1. Unsere Neuronen auf eine zugrunde liegende Astrozyten Monoschicht, was wiederum hält sich an ein Kollagen-Schicht auf eine Zahl 0 Dicke Deckglas ausgebreitet halten. Platte der Neuronen bei einer Dichte von etwa 500 Zellen pro Quadratzentimeter.
- Lassen Sie die Kulturen für 10-14 Tage wachsen, um synaptische Entwicklung und Reifung zu ermöglichen. Behandeln Sie die Kulturen am Tag in vitro 4 mit dem antimitotische AraC weiter Gliazellen Wachstum zu verhaften. Füttere sie am Tag in vitro 5 mit einem halben mittleren Austausch mit Neurobasal Medium plus B27 Ergänzung zum Überleben von Nervenzellen fördern.
- Während der Kulturzeit, einführen Behandlungen entwickelt, um die Zahl der funktionell Schweigen Synapsen verändern. Wir finden, dass man bequemer Weg, um einen großen Prozentsatz (~ 80%) der Glutamat-Synapsen Stille einer 4-stündigen Behandlung mit 30 mM Kalium ist. Längere Inkubationen mit schwächeren depolarisierende Stimuli induzieren ähnlich silencing 2. 4-stündige Stimulation mit 50 &mgr; M Forskolin, einem Aktivator der Adenylylcyclasen, können verwendet werden, um die Bevölkerung von stillen Terminals zu Studienbeginn 3 erwecken.
Visualizing stillen Synapsen
- Die Zellen sind eine relativ geringe Dichte mit gut getrennten neuritischen Prozesse am Tag in vitro 10-14 haben, um Visualisierung diskreter synaptischen Terminals mittels Fluoreszenzmikroskopie zu erleichtern.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 5 mM FM1-43FX in destilliertem Wasser. Die Aktie sollte in den dunklen bei 4 ° C gehalten werden Alle Experimente mit FM1-43FX sollte auch in der Dunkelheit durchgeführt werden.
- Fordern Sie die Kulturen für 2 Minuten mit 45 mM Kaliumchlorid in einem HEPES-gepufferte Kochsalzlösung mit 100 mM Natriumchlorid, 2 mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Glukose und 10 uM FM1-43FX. Diese Lösung sollte auch 1 uM NBQX und 25 uM D-APV an postsynaptische Rezeptoren zu blockieren und zu verhindern, wiederkehrende Signalisierung. Diese Herausforderung wird label synaptischen Terminals, die in der Lage Exozytose und Endozytose sind. Die Herausforderung der Zeit und Kraft sind entworfen, um mindestens eine Runde Exozytose aller verfügbaren Vesikel in der Recycling-Pool 4 verursachen. Allerdings ist die Herausforderung nicht aus, um zusätzliche Schalldämpfung von Endgeräten führen.
- Waschen Sie die Kultur für 3 bis 5 Sekunden nur, mit den gleichen HEPES-gepufferte Salzlösung ohne Kaliumchlorid, aber mit 500 uM Advasep-7 zu entfernen unspezifische Farbstoff 5. Beachten Sie, dass das Timing dieser Schritt kritisch, da längere Anwendung von Advasep-7 ist, führt zum Verlust aller FM1-43FX Kennzeichnung führen. Next waschen in HEPES-gepufferte ohne Advasep-7 Kochsalzlösung für fünf 2-Minuten-Takt.
- Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in PBS, pH 7,4 für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen einmal kurz mit PBS, dann für 15 Minuten in Blocking-Lösung mit 4% normalem Ziegenserum und 0,04% Triton X-100 in PBS inkubiert. Beachten Sie, dass FM1-43FX ist auch sehr empfindlich auf die Höhe der Triton X-100 verwendet hier und in späteren Schritten. Generell ist FM1-43FX Kennzeichnung am besten in Abwesenheit von Triton X-100, aber etwas Spülmittel ist notwendig, um Zellen für die anschließende Immunfärbung permeabilisieren. Wir haben empirisch gezeigt, dass 0,04% Triton X-100 optimal für die Prüfung der präsynaptisch stillen Synapsen bestimmt wird.
- Verdünnen Sie die primäre vGluT-1-Antikörper in Blockierungslösung bei einer Konzentration von 1:2500. Inkubieren Sie die Zellen unter leichtem Schütteln / Rotation in der verdünnten vGluT-1-Antikörper für 3 Stunden bei Raumtemperatur. Achten Sie darauf, Ihre Kulturschalen mit einer Folie zu verhindern Ausbleichen der FM1-43FX Farbstoff zu decken.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und dann Inkubieren Sie die Zellen mit einem Anti-Meerschweinchen-Antikörper, konjugiert mit einem Fluorophor mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften von FM1-43FX, die beiden Flecken unterscheiden. Für unser Experiment verwenden wir Alexa 555-konjugierten anti-Meerschweinchen-Antikörper bei 1:500 in Blocking-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen mit dem sekundären Antikörper unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen noch viermal in PBS und hängen Sie dann das Deckglas auf einem Objektträger aus Glas mit einem kleinen Tropfen Fluoromount-G. Seien Sie sicher zu orientieren dem Deckglas, so dass die Zellen der Gleitfläche. Lassen Sie die Dias über Nacht trocknen.
- Wir sind nun bereit, um Bilder von der aktiven und inaktiven Synapsen zu erwerben. Bereiten Sie eine 60 x Öl-Objektiv mit 1,4 numerische Apertur auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Setzen Sie ein Bild auf der Bühne, dass das Deckglas Seite nach dem Ziel. Nach der Fokussierung der Folie finden Sie ein Feld von Neuriten, die nicht allzu dicht. Es wird auch empfohlen, Bildgebung in der Nähe der Zelle soma zu vermeiden, als Rest-FM1-43FX Farbstoff dort bleiben können, auch nach ausgiebigem Waschen. Für unsere experimentellen Bilder, wir in der Regel in einer Feldgröße von 51 51 Mikrometer zu vergrößern.
- Erwerbenein z-Stapel von einem bestimmten Bereich abdecken zu einer Tiefe von 7,8 Mikrometer mit 27 0,3-Mikrometer-Schritten. Dieser Bereich ist genug, um die Dicke der Neuriten in unserer Kultur zu decken. Für jeden Schritt in der z-Stapel ersten Scan mit dem Laserlicht, dass Immunfluoreszenz der vGluT-1-Antikörper zu allen glutamatergen Synapsen in einem Mikroskop Bereich zu identifizieren anregt. Das gleiche Feld ist bei jedem Schritt für FM1-43FX Fluoreszenz erneut gescannt. Set mit neutraler Dichte Filter und Photomultiplier Gewinne konsequent unter allen Deckgläser für ein bestimmtes Experiment, bei gleichzeitiger Vermeidung Sättigung des Signals. Wir in der Regel erwerben ≥ 5 Felder pro Bedingung für jedes Experiment.
- Mit Analyse-Software, konvertieren Sie die z-Stapel in ein Composite Ein-Ebenen-Bild. Der Prozess verwenden wir für diese Umwandlung erzeugt ein Bild auf die maximale Intensität von jeder Ebene in jedem Pixel basiert. Das zusammengesetzte Bild ist Schwellenwert und vGluT-1-Terminals sind für die Analyse identifiziert, ohne Bezugnahme auf die FM1-43FX Fleck. Verschmutzte Stellen, die so genannte puncta, werden als Gebiete von Interesse versehen. Wir in der Regel wählen Sie 10 puncta pro Feld. Als nächstes wird der FM1-43FX Kanal Schwellenwert und die Regionen von Interesse sind, überlagert. Die Analyse-Software wird verwendet, um die Fluoreszenz-Intensität jedes Signals sowie die Fläche der einzelnen punctum zu quantifizieren. Ein absolutes Kriterium Pixel oder als Prozentsatz Pixel Kriterium zur Unterscheidung von inaktiven Synapsen aktiv werden.
Repräsentative Ergebnisse
- In unseren Kulturen finden wir, dass 70-80% der Glutamat-Synapsen durch vGluT-1 Färbung definiert, nachweisbar FM1-43 Färbung 2, 6-8 aufweisen. In überlagert Bilder von grünen FM1-43 Fluoreszenz und rot vGluT-1 Färbung dies als eine Fülle von gelben puncta widerspiegelt: Synapsen mit co-lokalisiert Marker. Diese werden durch die Pfeile angedeutet.
- Etwa 20-30% der (rot) vGluT-1-positiven puncta scheitern an (grün) FM1-43-Fluoreszenz über dem Ausgangswert zu haben. Dies sind die inaktiven präsynaptischen und ein Beispiel wird durch die Pfeilspitze gekennzeichnet.
- Ein Drittel der Bevölkerung von Synapsen wird auch beobachtet werden. Diese sind für die (grüne) FM1-43-Fluoreszenz aber ohne (rot) vGluT-1-Färbung. Positive Diese sind aktiv GABAergen Synapsen und ein Beispiel wird durch den Stern gekennzeichnet. Diese werden von den meisten unserer Analysen ausgeschlossen, kann aber explizit untersucht werden mit Hilfe eines vesikulären GABA-Transporter-Antikörper an die Stelle der vGluT-1-Antikörper.
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Discussion
Bedeutung
- Typischerweise Synapsen wird angenommen, dass durch die Freigabe Sender mit einem messbaren Wahrscheinlichkeit zu betreiben. Die Arbeit von uns selbst und andere macht es offensichtlich, dass einige Synapsen refraktär Freisetzung von Neurotransmittern sind, trotz einer vollständigen Ergänzung der vesikulären Neurotransmitter-Transporter und andere wichtige präsynaptischen Marker 2, 6-8. Wir haben bereits, dass die basalen Netzwerk-Aktivität in Neuronen entscheidend für diese Bevölkerungsgruppe von inaktiven Erhalt von Synapsen wird angezeigt.
Kritische Schritte
- Aufnahme einer kurzen Waschung mit 500 uM Advasep-7 verbessert die Qualität der FM1-43FX Färbung. Allerdings wird auch ein leichter Anstieg in der Zeitpunkt dieser laviert über 5 Sekunden in den Verlust von FM1-43FX Kennzeichnung führen.
- FM1-43FX ist sehr empfindlich auf die Höhe der Triton X-100 in der Immunfärbung Teil des Protokolls verwendet wird. FM1-43FX Kennzeichnung ist am besten in Ermangelung einer Triton X-100, aber etwas Spülmittel ist notwendig, um Zellen für vGluT-1-Immunfärbung permeabilisieren. Wir haben empirisch nachgewiesen, dass 0,4% Triton X-100 optimal für die Prüfung der präsynaptisch stillen Synapsen bestimmt wird.
Änderungen
- Man kann mit einem postsynaptischen Marker als 3 rd Fleck, um sicherzustellen, vGluT-1-Färbung stellt bona fide Synapsen: Berührungspunkte zwischen Vesikel-laden-Terminals und postsynaptischen Rezeptor-Cluster.
- Man kann auch festlegen, dass andere präsynaptischen Antikörper Marker wie die pan-synaptischen Marker, SV2, oder VGAT verwenden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt DA018109 und MH78823 und NIH Neuroscience Blueprint Core-Stipendium P30NS057105 zu Washington University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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