Summary
Мы покажем, как для записи вспышка ответов от одного конуса мыши, используя всасывания электрода.
Abstract
Палочек и колбочек фоторецепторов в сетчатке отвечают за свет обнаружения. В темноте, циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы во внешнем сегменте являются открытыми и позволяют катионов течь постоянно внутрь через мембрану, деполяризующего клетки. Освещенность вызывает закрытие каналов СПГ, блоки внутрь катионного тока, и таким образом приводит к ячейке гиперполяризации. На основе полярности фоторецепторов, методом всасывания запись была разработана в 1970-х годов, что, в отличие от классического патч-зажим технику, не требует проникновения в мембране
Protocol
Создание электродов
- Сделать запись электродов использованием съемника микропипетки и польский электродов с отоплением нити под микроскопом. Для мыши конус одноклеточных всасывания записи, внутренний диаметр на конце электрода составляет около 6-7 мкм.
- Подготовка электродов сравнения. Взвесьте 1% агара в дистиллированной воде. Растопить агар решение в ванну с горячей водой. Заполните стеклянные пипетки (L = 100 мм, OD / ID = 1/0.75 мм) с 1% агара использованием шприца. Укрепить агар при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Разрежьте пополам пипетки помощью алмазной ножом.
- Замочите электродов в раствор сравнения, по крайней мере 24 часов при температуре 4 ° С.
Настройка эксперимента
- Темные адаптировать мышь в черном клетку на ночь.
- Подготовка 100 мл раствора ведения и 1 л перфузии раствором (см. ниже) и фильтр решение.
- Растворяют 0,1% BSA и 10 мМ глюкозы в 20 мл раствор ссылки.
- Калибровка интенсивности света в оптических стимулятор использованием фотометра.
- Горы записи камеры на сцене инвертированного микроскопа.
- Bubble перфузии раствора с 95% O 2 / 5% CO 2, инкубировать ее в 40 ° С водяной бане для увеличения растворимости СО 2. Решение вытекает из бутылки записи камеры, проходящей через керамический резистор нагревая это до 36-38 ° С. Нагреватель должен быть расположен как можно ближе к записи камеры позиции, желательно на стадии микроскоп.
- Настройте регулятор расхода для потока скоростью около 1-1,5 мл / мин.
- Заполните записи электрода со ссылкой решение. Вставьте электрод в держатель электрода. Убедитесь Есть нет пузырьков в электроде. Горы держатель на headstage усилителя. Подключите держатель для всасывающего устройства, который построен путем соединения трубки, частично заполненной минеральным маслом в сторону порта из держателя электрода. Другой конец трубки соединен с небольшим резервуаром нефтепродуктов, к которым давление может быть применен в рот.
- Подключение электрода к другому полюсу headstage. Привязка тепловые пара (ТС) для электрода сравнения. Убедитесь, что электрод и ТК советы близко друг к другу так, чтобы температура чтении принимается близко к клетке как это возможно.
- Включите ИК-подсветки для визуализации электрода. Электрод рассматривается инфракрасная камера подключена к монитору. Центр электрода изображение на поля зрения и монитора с помощью микро-манипулятором.
- Отрегулируйте положение кончика электрода близко (2-4 мм), чтобы кончик электрода записи.
- Отрегулируйте напряжение постоянного тока на нагреватель так, чтобы температура раствора составляет около 36-38 ° C.
- Выполнить печать, чтобы проверить сопротивление электрода записи, как правило, около 900 кОм.
Изоляция мыши сетчатки
- Под тусклый красный свет, эвтаназии темно-адаптированной мышь с CO 2 и цервикальной дислокации. Марк глазные яблоки с помощью иглы горячей факел металла прижигание наиболее спинной точки склеры чуть-чуть. Выявлять глазные яблоки с помощью ножниц. Все последующие процедуры проводятся под инфракрасным излучением.
- Hemisect глазных яблок под микроскопом с ИК подсветкой и преобразователей.
- Удалить роговицы и хрусталика. Удалить столько стекловидного насколько это возможно.
- Для записи M-конус ответов, удалить вентральной части наглазник 4 с лезвием судя по прижигания марки.
- Пил сетчатку от слоя пигментного эпителия.
- Свести сетчатки и положите его на дно чашки Петри, заполненные 1-2 решение ссылкой мл.
- Нарежьте сетчатки на мелкие тонкие части, используя лезвие бритвы и инкубировать подготовку в светонепроницаемый ящик насыщенной чистым кислородом.
Записи
- Выключите обогреватель временно. Коммутатор перфузии поток обойти трубы, чтобы предотвратить камеры от высыхания.
- Слейте большую часть раствора в камере используя часть Kimwipe ткани. Передача сетчатки подвески записи камеры с помощью стеклянной пипетки.
- Подождите около 2 минут, пока сетчатка ломтиками успокоиться. Коммутатор перфузии обратно. Включите нагреватель.
- Включите инфракрасную подсветку для визуализации подготовки. Поиск часть сетчатки лежал на камеру с наружных сегментов фоторецепторов торчащие (см. пример рисунок). Нарисуйте внутренние сегменты мягко в электроде всасывания. В этой конфигурации, несколько ядер и внутренний сегменты должны быть вовлечены в электроде. Запись фотоотклика на яркую вспышку для проверки конуса внутренний сегмент находится в электроде и является ли ячейка исцелитьтвой, судя по реакции кинетики и амплитуды.
- Нижняя минеральных водохранилище применить небольшое отрицательное давление до кончика электрода, чтобы помочь провести внутренний сегмент в электроде.
- Запись тест-вспышкой ответы от тусклом до ярко интенсивности раз хороший ячейка найдена. Испытание вспышки осуществляется от калиброванного оптического стимулятор 5. Интенсивность вспышки и длины волны контролируются набором фильтры нейтральной плотности и узкие фильтры интерференционной полосы, соответственно. Испытание длительность вспышки (20 мс) управляется компьютером управляемых жалюзи.
Решения
- Мышь перфузии решение: 112,5 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 20 мМ NaHCO 3, 3 мМ Na сукцинат, 0,5 мМ Na глутамата, 0,02 мМ ЭДТА и 10 мМ глюкозы.
- Мышь записи электрода решение: 140 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 3 мМ HEPES (рН 7,4), 0,02 мМ ЭДТА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одноклеточный всасывания записи с фоторецепторных клеток был разработан три десятилетия назад. Это дает нам возможность записи трансмембранный ток изменение, вызванное световой стимуляции, не проникая клеточной мембраны. Из-за высокой межклеточной адгезии, трудно выделить одну здоровую палочек и колбочек сетчатки от мыши, как амфибии сетчатки, и трудно найти индивидуальный конусы из-за низкого процента (3%) и небольшого размера. Внутренний сегмент в (IS-в) способ записи позволяет преодолеть эту трудность, тока записи от внутреннего сегментов нескольких фоторецепторов, среди которых конус может быть включен. У диких мышей типа, реакция должна быть комбинация из палочек и колбочек. Постоянный свет фон может быть использовано для подавления стержень ответов. В этом видео мы использовали Tα-/ - сетчатка, в которой стержни не может ответить на световое раздражение, так как они не имеют α-субъединицы G-белка трансдуцином 6. Таким образом, фотоотклик только из конусов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Поддержке развития карьеры награду от исследований в области профилактики слепоты, NIH грант Е.Ю. 019312, и неограниченный грант исследований в области профилактики слепоты и EY 02 687 (кафедра офтальмологии и Визуальный наук в Университете Вашингтона).
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms. J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation. J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).
