Summary
Biz bir emme elektrot kullanarak tek bir fare kozalakları flaş cevaplarını kaydetmek için nasıl gösterecektir.
Abstract
Çubuk ve koni retinadaki fotoreseptör ışık algılama sorumludur. Karanlıkta, dış segmente siklik nükleotid kapılı (CNG) kanalları açıktır ve katyonların hücre depolarize zarından içeri doğru istikrarlı bir şekilde akmasına izin verin. Işığa maruz kalma CNG kanalları, bloklar içe katyon akım, ve böylece hücre hiperpolarizasyon sonuçları kapatılması tetikler. Fotoreseptörlerin polarite dayanarak, bir emme kayıt yöntemi klasik yama klemp tekniği aksine, plazma zarı delinmesi gerektirmez, 1970'li yıllarda geliştirilen
Protocol
Elektrotlar yapma
- Mikropipet çektirmenin kullanarak kayıt elektrotları olun ve mikroskop altında ısıtma filament elektrotlar lehçe. Fare koni tek hücreli emme kayıt için, elektrot ucu iç çapı yaklaşık 6-7 mm.
- Referans elektrot hazırlayın. Distile su içinde% 1 agar tartılır. Agar çözüm sıcak su banyosunda eritin. Şırınga kullanarak% 1 agar ile cam pipetler (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) doldurun. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında agar katılaşmaya.
- Pipetler bir elmas bıçak kullanarak parçaya kesin.
- 4 en az 24 saat için referans çözüm referans elektrotlar Soak ° C.
Denemenin kurulumu
- Karanlık bir gecede, siyah bir kafes içinde bir fare adapte.
- 100 ml referans çözümü ve 1 L perfüzyon çözeltisi (aşağıya bakın) hazırlayın ve çözüm filtre.
- % 0,1 BSA ve 10 mM Glukoz, 20 ml referans çözelti içinde çözülür.
- Işık şiddetinin fotometre kullanarak optik stimülatörü kalibre edin.
- Inverted mikroskop aşamasında kayıt odasının monte edin.
- % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile Bubble perfüzyon çözüm, CO 2 çözünürlüğü artırmak için 40 ° C su banyosunda inkübe edin. Çözüm şişe, 36-38 ile ısınma seramik direnç geçerek kayıt odası ° C akar Isıtıcı, mikroskop aşamasında ideal kayıt odasına mümkün olduğunca yakın olarak yer almalıdır.
- 1-1.5 ml / dak akış hızı akış regülatörü ayarlayın.
- Kayıt elektrot referans solüsyonu ile doldurun. Bir elektrot tutucu elektrot yerleştirin. Elektrot hiçbir baloncuklar olmadığından emin olun. Amplifikatör headstage sahibi monte edin. Elektrot tutucu yan port kısmen mineral yağ ile dolu tüp bağlayarak yerleşik bir emme cihazı, tutucu bağlayın. Hortumun diğer ucunu ağız yoluyla hangi basınç uygulanabilir, mineral yağ küçük bir rezervuar bağlı.
- Referans elektrot headstage diğer direğe bağlayın. Isıl çift (TC), referans elektrot bağlayın. Elektrot ve TC ipuçları birbirine yakın sıcaklık okuma, mümkün olduğu kadar hücre yakın olarak alınır, böylece emin olun.
- Elektrot görselleştirmek için kızılötesi aydınlatma açın. Elektrot bir monitöre bağlı kızılötesi kamera tarafından görüntülendi. Merkezi görme alanı ve mikro-manipülatör kullanarak monitör elektrot görüntü.
- Referans elektrot kayıt elektrot ucu ucuna yakın (2-4 mm) konumunu ayarlayın.
- Çözeltinin sıcaklığı 36-38 hakkında ° C olacak şekilde ısıtıcı DC gerilim ayarlayın
- Normalde 900 kÊ hakkında, kayıt elektrot direnci kontrol etmek için bir sızdırmazlık testi çalıştırın.
Fare retina Yalıtımlı
- Loş kırmızı ışık altında, CO 2 ve servikal dislokasyon ile karanlık adapte fare euthanize. Biraz sklerasına en dorsal noktası dağlama, sıcak metal meşale ucu kullanarak gözbebekleri işaretleyin. Makas kullanarak gözbebekleri aydınlatmak. Sonraki tüm işlemler, kızılötesi ışık altında yapılmaktadır.
- Kızılötesi aydınlatma ve görüntü dönüştürücüler ile mikroskop altında gözbebekleri Hemisect.
- Kornea ve lens çıkarın. Vitreus kadar mümkün olduğu kadar çıkarın.
- M-koni yanıtları kaydetmek için, koter işareti yargılamak bir jilet ile Göz yuvası 4 ventral kısmı çıkarın.
- Retina pigment epitel tabakası soyulur.
- Retina düzleştirin ve 1-2 ml referans solüsyonu ile dolu Petri kabı alt üzerine yerleştirin.
- Retinanın bir jilet kullanarak küçük ince parçalar halinde dilimleyin ve saf oksijen ile doymuş bir ışık geçirmez kutu hazırlanmasında kuluçkaya yatmaktadır.
Kayıtlar
- Isıtıcı geçici olarak kapatın. Odasının kurumasını önlemek için bir by-pass boru perfüzyon akım anahtarı.
- En Kimwipe dokusunun bir parçası kullanarak odasında çözüm boşaltın. Cam bir pipet kullanarak kayıt odasına retina süspansiyon aktarın.
- Retina dilim yerleşmek kadar yaklaşık 2 dakika bekleyin. Perfüzyon geçin. Isıtıcıyı açın.
- Hazırlık görselleştirmek için kızılötesi aydınlatma açın. Retinanın fotoreseptör dış segmentleri (örneğin şekle bakınız) yapışmasını odasına yatarken bir parça için ara. Emme ile elektrot içine yavaşça iç segmentleri çizin. Bu yapılandırmada, birkaç çekirdek ve iç bölümleri elektrot çizilmelidir. Bir koni iç segment hücre iyileşmesi olup olmadığını elektrot olup olmadığını test etmek için parlak bir flaş photoresponse KayıtSenin, cevap kinetiği ve genlik yargılamak.
- Mineral deposu, yardımcı elektrot iç segment tutun için elektrot ucu hafif negatif basınç uygulamak için indirin.
- Kayıt test flaş yanıtları için loş aydınlık şiddeti iyi bir hücre bir kez. Test yanıp söner kalibre edilmiş bir optik Stimülatörü 5 sağlanmaktadır. Flash yoğunluğu ve dalga boyu sırasıyla, bir dizi nötral yoğunluk filtreleri ve dar bant girişim filtreleri tarafından kontrol edilir. Test flaş süresi (20 ms), bilgisayar kontrollü kepenkler tarafından kontrol edilir.
Çözümler
- Fare perfüzyon çözüm: 112.5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM süksinat, Na, 0.5 mM Na glutamat, 0.02 mM EDTA ve 10 mM glukoz.
- Fare kayıt elektrot çözüm: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7.4), 0.02 mM EDTA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fotoreseptör hücrelerinin Tek hücreli emme kayıt 3 yıl önce geliştirilmiştir. Bu hücre zarının delinmesi ışık stimülasyonu ile indüklenen trans-membran geçerli değişikliği kaydetmek için bize sağlar. Yüksek hücre-hücre adezyon Çünkü, amfibi retina gibi fare retinanın sağlıklı tek bir çubuk ve koni izole etmek zor ve düşük oranda (% 3) ve küçük boyutu nedeniyle bireysel konileri bulmak zordur. Iç kademeli (IS-in) kayıt yöntemi bir koni dahil olabilir, bunların arasında birkaç fotoreseptörlerin iç kesimleri güncel kayıt Bu zorluğun üstesinden gelir. Vahşi tip fare, yanıt çubuklar ve koniler kombinasyonu olmalıdır. Kararlı bir arka plan ışığı çubuk tepkileri bastırmak için kullanılabilir. Retina, G-protein transdusin 6 α-altbirim eksikliği gibi çubuklar, ışık stimülasyonuna yanıt vermiyor hangi - Bu video, Tα / kullanılır. Bu nedenle photoresponse, sadece kozalakları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Körlük ve EY 02.687 (Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları ve Görsel Bilimleri Bölümü) önleyin Araştırma Körlük, NIH hibe EY 019.312 ve sınırsız ödenekle Önlemek için Kariyer Geliştirme Ödülü Research tarafından desteklenir.
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms. J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation. J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).
