Summary
इस प्रक्रिया के साथ या बिना सर्पिल किनारी और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स Corti के murine अंग के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हम भी electroporation द्वारा Corti explant के अंग में एक exogenous रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
सभी स्तनधारियों में ऑडिशन के लिए संवेदी उपकला Corti के बढ़ते अंग है कि भीतरी कान (अंजीर 1) के शंख आकार कोक्लीअ के भीतर रहता है के साथ स्थित है. विकासशील कोक्लीअ, जो श्रवण प्रणाली की mechanosensory कोशिकाओं में बालों की कोशिकाओं के भीतर बालों की कोशिकाओं की एक पंक्ति और तीन आधार और मध्य मुड़ता में से चार (शिखर बारी में) बाहरी बालों की कोशिकाओं की पंक्तियों में जुड़ रहे हैं कि Corti के अंग की लंबाई अवधि. बालों की कोशिकाओं तंत्रिका आवेगों है कि मस्तिष्क की व्याख्या कर सकते हैं में आधारी झिल्ली की ध्वनि प्रेरित कंपन यांत्रिक transduce. Sensorineural सुनवाई हानि के अधिकांश मामलों में या cochlear बालों की कोशिकाओं की मौत में शिथिलता के कारण कर रहे हैं.
श्रवण अनुसंधान के क्षेत्र में एक तेजी से आवश्यक उपकरण अलगाव है और अंग 1,2,9 explant के इन विट्रो संस्कृति में . एक बार अलग, explants मानक के बारे में जानकारी, विषम, या चिकित्सकीय फिजियोलॉजी प्रदान करने के कई तरीके में उपयोग किया जा सकता है. जीन अभिव्यक्ति, stereocilia गतिशीलता सेल और आण्विक जीव विज्ञान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाल सेल पुनर्जनन के लिए जैविक दृष्टिकोण Corti explants के अंग के प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के उदाहरण हैं.
इस प्रोटोकॉल और नवजात चूहों से Corti के अंग के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है. साथ वीडियो माउस पिल्ले से अस्थायी हड्डी के अलगाव के लिए stepwise दिशाओं, और कोक्लीअ, सर्पिल, बंधन, और Corti के अंग के बाद अलगाव भी शामिल है. एक बार अलग संवेदी उपकला और मढ़वाया जा सकता है अपनी संपूर्णता में इन विट्रो में सुसंस्कृत, या के रूप में एक आगे dissected सूक्ष्म अलग है कि सर्पिल किनारी और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स का अभाव है. इस पद्धति का उपयोग करके, प्राथमिक explants 7-10 दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है. इस प्रक्रिया की उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में, Corti explants के अंग एक exogenous DsRed रिपोर्टर जीन के साथ electroporated जाएगा. इस विधि के अन्य तरीकों पर प्रकाशित एक सुधार प्रदान करता है क्योंकि यह अलगाव, microdissection, और Corti के अंग के प्राथमिक संस्कृति के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्पष्ट, और stepwise निर्देश प्रदान करता है है.
Protocol
दिवस 1. बंध्याकरण और गिलास coverslips के कोटिंग.
- एक autoclave में कांच खुर्दबीन coverslips बाँझ सूखी.
- एक पूर्व निष्फल सेल चार अच्छी तरह से संस्कृति डिश के दो कुओं में निष्फल coverslips रखें.
- कोट के साथ पाली L-ओर्निथिन 01:01 और laminin coverslips 20% भ्रूण गोजातीय (FBS) 4 पर रातोंरात सीरम डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक
- 400 μL पाली - एल - ओर्निथिन (0.01% 4 में संग्रहीत समाधान ° C)
- 400 μL laminin (50 μg / एमएल शेयर -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत समाधान)
- 200 μL FBS (-20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत)
- हीट विच्छेदन उपकरण एक 150 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात बाँझ.
- 10% सीरम और 10 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त संस्कृति मध्यम बनाओ.
- 90 एमएल Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम
- 5 एमएल FBS (-20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत)
- 5 एमएल घोड़े सीरम (-20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत)
- 10 μL एम्पीसिलीन (10 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान 4 में संग्रहीत ° सी)
2 दिन. Corti के अंग के अलगाव.
- सकारात्मक प्रवाह विच्छेदन हुड जीवाणुरहित.
- 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर बारी
- 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों स्प्रे और उपयोग करने से पहले 5 मिनट रुको.
- रंध्र मैग्नम ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग के आधार पर सिर काटना पिल्ला माउस (P4).
- संक्षेप में 10 सेमी 70% इथेनॉल युक्त डिश में सिर कुल्ला .
- एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर epidermis निकालें.
- बाण के समान सीवन एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर के साथ cranium खोलें और तब अग्रमस्तिष्क द्विविभाजित. आगे विच्छेदन के लिए दुम अग्रमस्तिष्क रखें.
- अग्रमस्तिष्क सेरिबैलम, और brainstem कुंद विच्छेदन का उपयोग निकालें.
- लौकिक हड्डियों (अंजीर 2A) निकालें, उन्हें संक्षेप में, 70% इथेनॉल डुबकी और उन्हें एक 3 मिमी बाँझ HBSS युक्त डिश के लिए स्थानांतरण.
- संदंश का प्रयोग, bulla और टेम्पोरल हड्डी का पथराया हुआ भाग से आसपास के ऊतकों को हटा दें.
- शंख आकार कोक्लीअ (अंजीर 2B) का पता लगाएँ और यह vestibular प्रणाली का उपयोग संदंश से अलग है.
- विकास के इस स्तर पर, बोनी भूलभुलैया पूरी तरह से और नहीं calcified है आसानी से संदंश का उपयोग dissected. सावधान बेसल अंत में शुरू और apically चलती संदंश का उपयोग जुदाई से कोक्लीअ की बोनी भूलभुलैया निकालें.
- सर्पिल बंधन और Corti के संलग्न अंग modiolus (अंजीर 2C) के सर्पिल के साथ coiled है. ध्यान संदंश का उपयोग करने के आधार के हुक क्षेत्र में सर्पिल बंधन हासिल है और यह unwinding के रूप में आप के apically कदम के द्वारा Corti के अंग निकालने.
- आधार पर शुरू, Corti के अंग # 55 ठीक संदंश (अंजीर 2 डी) का उपयोग कर सर्पिल बंधन से हटा दें.
माइक्रो Corti संवेदी उपकला (वैकल्पिक) के अंग के अलगाव. - Corti दो का उपयोग कर आधार के हुक क्षेत्र के अंग निकालें आधा सीसी स्थायी रूप से संलग्न U-100 साढ़े 28G संदंश के रूप में सुई के साथ इंसुलिन सीरिंज .
- शीर्ष पर शुरू, भीतरी बालों की कोशिकाओं की पंक्ति से सर्पिल किनारी हटाने और basally आगे बढ़ना (अंजीर 2 ई एफ).
Corti explant के अंग चढ़ाना - संस्कृति कुओं से poly-L-ornithine/laminin/FBS समाधान निकालें और संस्कृति के माध्यम से 130 μl जोड़ें.
- संस्कृति में लेपित गिलास और अच्छी तरह से उन्मुख explant इतना है कि बालों की कोशिकाओं की cilia इशारा कर रहे हैं coverslip Corti के dissected अंग स्थानांतरण.
- संस्कृति में मध्यम अच्छी तरह से एक 200 μL पिपेट का उपयोग कर निकालें. सुनिश्चित करें कि आधारी झिल्ली लेपित गिलास coverslip के साथ ठोस संपर्क करता है.
- ध्यान से Corti के अंग एक 200 एमएल पिपेट का उपयोग करने के लिए संस्कृति के माध्यम से 130 μL जोड़ें. Corti के अंग की सतह पर दो बूँदें लागू करें और फिर धीरे coverslip की ओर शेष मात्रा जोड़ने. सुनिश्चित करें कि Corti का अंग संस्कृति मीडिया में नाव नहीं करता, लेकिन coverslip करने के लिए चिपका रहता है.
- 37 ° C 5% सीओ 2 की उपस्थिति में रातोंरात सेते हैं.
3 दिन. Corti के सुसंस्कृत अंग में रिपोर्टर जीन की electroporation.
- Corti संस्कृति के अंग संस्कृति के माध्यम से निकालें.
- 1 मिनट के लिए 130 μL एच 2 हे जोड़ें और फिर एक 200 μL पिपेट का उपयोग हटायें .
- DsRed प्लाज्मिड रिपोर्टर (2mg एमएल / 2 एच ओ -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के 30 μL जोड़ें.
- इतना है कि एक micromanipulator का उपयोग electroporator के इलेक्ट्रोड अग्रिम anode एकएन डी कैथोड संस्कृति के दोनों ओर कर रहे हैं.
- (27V, 30 एमएस की अवधि, 10 नाड़ी गाड़ियों) पल्स Corti explant संस्कृति के अंग में रिपोर्टर जीन electroporate उत्पन्न करता है.
- वैकल्पिक: दोनों modiolar और सर्पिल explant के बंधन पक्षों पर transgene की electroporation सुनिश्चित नाड़ी के polarity रिवर्स.
- 5 मिनट रुको.
- डीएनए समाधान (2 भागों डीएनए के लिए 3 भागों Fugene): Fugene 6 की 130 μL जोड़ें . यह समाधान electroporation प्रक्रिया की शुरुआत (20 कदम) एक लामिना का प्रवाह हुड में एक 3 एमएल दौर नीचे polystyrene टेस्ट ट्यूब का उपयोग करने के लिए पहले तैयार किया जाना चाहिए. इस समाधान बनाने के लिए:
- टेस्ट ट्यूब Opti - सदस्य (4 ° C पर संग्रहीत) के 2.4 μL जोड़ें.
- टेस्ट ट्यूब Fugene 6 अभिकर्मक (4 ° C पर संग्रहीत) के 0.6 μL जोड़ें. Fugene सीधे Opti-सदस्य और जोड़ टेस्ट ट्यूब के पक्ष के साथ सीधे संपर्क से बचने सुनिश्चित करें.
- 1 सेकंड के लिए भंवर.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं.
- 2.0 μL DsRed संवाददाता प्लाज्मिड डबल असहाय डीएनए (100 μg डीएनए / एमएल एच 2 हे aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) जोड़ें.
- 1 सेकंड के लिए भंवर.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं.
- संस्कृति के माध्यम से 200 μL जोड़ें.
- 1 सेकंड के लिए भंवर.
- 37 में डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में रातोंरात सेते हैं.
- अच्छी तरह से संस्कृति के लिए 2 एमएल संस्कृति के माध्यम जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस 10 दिनों के लिए सेते हैं.
प्रतिनिधि परिणाम
हम एक प्रसवकालीन माउस से Corti के अंग के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. प्रक्रिया के रूप में भ्रूण दिन के रूप में युवा 16 प्रसव के बाद दिन के बारे में 6 चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, पर जो बात बोनी भूलभुलैया पर्याप्त विच्छेदन बोझिल सौंपनेवाला calcified हो जाता है. एक बार Corti के अंग dissected है, और यह मढ़वाया हो सकता है अपनी संपूर्णता (3 अंजीर) में या सूक्ष्म पृथक संवेदी उपकला (4 अंजीर) के रूप में सुसंस्कृत. हम आगे तकनीक Corti के सुसंस्कृत अंग में exogenous जीन व्यक्त प्रस्तुत किया है. organotypic संस्कृति के अध्ययन के कई अन्य Corti जीन अभिव्यक्ति का उपयोग RT-पीसीआर या स्वस्थानी संकरण में, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं या exogenous स्टेम कोशिकाओं सूक्ष्म अलग का उपयोग के साथ सह संस्कृति Corti के अंग के अंग के विश्लेषण के रूप में में, प्रकार के लिए उपयोगी है 3, या बाल कोशिका मृत्यु और उत्थान की इन विट्रो विश्लेषण में.
चित्रा 1. Corti P4 murine अंग के क्रॉस अनुभाग. (ए) एक P4 माउस से प्राप्त एक cryosectioned कोक्लीअ के बेसल बारी से एक क्रॉस सेक्शन murine इस प्रोटोकॉल में वर्णित कोक्लीअ के सामान्य संरचना को दिखाता है. स्कैला मीडिया सर्पिल बंधन और हलकी लीक vascularis laterally द्वारा bordered है, एस रेइस्स्नेर झिल्ली से ऊंचा, सर्पिल किनारी medially, और आधारी inferiorly झिल्ली. बॉक्स संकेत बी में विस्तार क्षेत्र (बी) Corti का अंग आधारी झिल्ली के बेहतर पक्ष पर स्थित है और भीतरी बालों की कोशिकाओं, बाहरी बालों की कोशिकाओं की तीन पंक्तियों में, और उनके संबंधित समर्थन कोशिकाओं की एक पंक्ति में शामिल है. डैश्ड लाइन 1 आधारी झिल्ली कि Corti विच्छेदन के इस अंग के दौरान हटा दिया जाता है साथ स्थान इंगित करता है. डैश्ड लाइन 2 आधारी झिल्ली है कि सूक्ष्म - अलगाव प्रक्रिया के दौरान हटा दिया है साथ स्थान इंगित करता है. ग्रीन calbindin immunohistochemical लेबलिंग, जो किनारी सर्पिल के दांतों के बीच कोशिकाओं, cochlear बालों की कोशिकाओं, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सर्पिल बंधन और 7 vascularis हलकी लीक की कोशिकाओं लेबल को इंगित करता है. DAPI लेबलिंग के नाभिक नीले रंग में है.
चित्रा 2. Corti विच्छेदन पर प्रकाश डाला के अंग के साथ वीडियो से Corti विच्छेदन के अंग.) कोक्लीअ और पृथक टेम्पोरल हड्डी (लाल) के भीतर स्थित vestibular प्रणाली, बी) कोक्लीअ की बोनी भूलभुलैया, सी) सर्पिल बंधन और संलग्न छवियाँ सर्पिल बंधन हटाने Corti बोनी भूलभुलैया, डी को हटाने के बाद अंग) और हलकी लीक vascularis (लाल) Corti, ई के अंग से) सर्पिल किनारी (लाल) से संवेदी उपकला के सूक्ष्म अलगाव, और एफ) पृथक सर्पिल किनारी (बाएं) और संवेदी उपकला (दाएं).
चित्रा 3. Corti explant संवर्धित अंग डीआईसी के अंग दिखा छविCorti के एक P4 माउस Atoh1 nGFP कि पांच दिनों के रूप में वर्णित के लिए पृथक, मढ़वाया, और सभ्य था. यह माउस आनुवंशिक इंजीनियर है इतना है कि कोशिकाओं है कि समर्थक बाल सेल जीन atonal homolog 1 (Atoh1 उर्फ Math1) व्यक्त एक्ज़िबिट एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि 8 नाभिक को स्थानीय है . इन चूहों से Corti के अंगों के सभी बाल सेल नाभिक में एक परमाणु GFP लेबल एक्ज़िबिट और इसलिए संवेदी उपकला के एक epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग आसान दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. अपेक्षाकृत बड़े सर्पिल किनारी संवेदी उपकला करने के लिए पार्श्व में देखा जा सकता है. Mesenchymal कोशिकाओं है कि Corti के अंग से उत्पन्न है explant से दूर चले गए हैं. ब्लू परमाणु लेबल DAPI है.
चित्रा 4. माइक्रो पृथक संवेदी उपकला Epifluorescent संवेदी उपकला कि Corti के एक P4 murine अंग से पृथक किया गया है के रूप में वर्णित है और रातोंरात सुसंस्कृत से प्राप्त छवि. सूक्ष्म अलग तो 4% paraformaldehyde में तय किया गया था और मायोसिन 7a जो cochlear बालों की कोशिकाओं लेबल immunolabeling के लिए कार्रवाई की. नोट 3 आंकड़े से अपेक्षाकृत बड़ा सर्पिल किनारी के अभाव. ब्लू परमाणु लेबल DAPI है.
चित्रा 5. Corti के सुसंस्कृत अंग में DsRed रिपोर्टर जीन की electroporation P4 Atoh1 nGFP माउस पिल्ले से Corti के पूरे अंगों अलग थे, मढ़वाया, और फिर DsRed रिपोर्टर जीन के रूप में वर्णित है और फिर एक epifluorescent खुर्दबीन के नीचे देखा के साथ electroporated. Corti explant के अंग की कोशिकाओं है कि ट्रांसजेनिक DsRed संवाददाता प्रोटीन व्यक्त संवेदी उपकला एक्ज़िबिट एक हरे रंग की परमाणु प्रतिदीप्ति के एक लाल प्रतिदीप्ति और अंतर्जात कोशिकाओं एक्ज़िबिट. ट्रांसजेनिक कोशिकाओं सर्पिल किनारी और संवेदी उपकला भर में देखा जा सकता है है.
Discussion
वहाँ कई जानकारी है कि इस प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कर रहे हैं. टेम्पोरल हड्डी अलगाव से कम Corti ऊष्मायन, अधिक से अधिक मौका है कि अंगों coverslip और व्यवहार्य अंग संस्कृतियों में परिणाम देते हैं जाएगा के अंग के लिए समय है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है विच्छेदन और इन्क्यूबेटर में रखने के अंगों के बीच समय की राशि की सीमा. एंटीबायोटिक का चुनाव भी महत्वपूर्ण है, के बाद से कई aminoglycoside एंटीबायोटिक दवाओं ototoxic हैं और बाल कोशिका मृत्यु में परिणाम देगा. हालांकि यह बेहतर है के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग को पूरी तरह छोड़, इस संभावना संदूषण के लिए खुला छोड़ देता है. इसलिए, हम संभावित संदूषण समस्याओं को दूर करने के लिए एक सामान्य नियम के रूप में 10 μg / एमएल एम्पीसिलीन का उपयोग का सुझाव देते हैं.
इस का सबसे परेशानी पहलू है, और Corti के अंग के प्राथमिक संस्कृति लिए अन्य प्रक्रियाओं, अंगों की प्रवृत्ति बंद ऊष्मायन के दौरान प्लेटें नाव है. हालांकि अस्थायी अंग संस्कृतियों 5-7 दिनों के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं, वहाँ संवर्धन अस्थायी अंगों की कमियां हैं. उदाहरण के लिए, तैर अंग संस्कृतियों अक्सर माइक्रोस्कोपी समस्याग्रस्त प्रतिपादन 4-5 दिनों के बाद खुद पर गुना. बाद में, जब अंग है कि coverslip चिपका गया है की तुलना में अंग के संरचनात्मक अखंडता समझौता बन सकता है. हमने पाया है कि निम्नलिखित तकनीकों मदद करने के लिए सुनिश्चित करें कि Corti के अंग संस्कृति मीडिया में नाव नहीं करता, लेकिन रहता है coverslip करने के लिए चिपका. सबसे पहले, कोट 01:01 polyornithine / laminin में कांच coverslips 20% के रूप में वर्णित FBS के साथ पूरक है. रातोंरात इस प्रोटोकॉल के लिए बुलाया ऊष्मायन न्यूनतम समय है कि थाली लेपित होना चाहिए है. हमारी प्रयोगशाला में, हम अक्सर कोट प्लेटों है कि हम एक सप्ताह के लिए की जरूरत है और उन्हें 4 बजे रखने के सभी डिग्री सेल्सियस दिन तक पहले जब हम एक रात ऊष्मायन के लिए इनक्यूबेटर के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए उपयोग करने के लिए. दूसरा, के बाद अंगों लेपित coverslips जाया जाता है, पूरबी explant इतना है कि बालों की कोशिकाओं की cilia चेहरा. इस उन्मुखीकरण संस्कृति पकवान आधारी झिल्ली के पालन को सुविधा होगी. तीसरा, अच्छी तरह के भीतर मीडिया लेपित पकवान प्रत्यय हटायें explant. यह संस्कृति डिश और आधारी झिल्ली के बीच संपर्क को सुनिश्चित करने और कांच का पालन explants की क्षमता में वृद्धि होगी. यह भी बालों की कोशिकाओं की पंक्तियों के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में मदद करेंगे. अंत में, ध्यान Corti के अंग एक 200 μL क्षमता पिपेट का उपयोग कर की सतह पर मध्यम संस्कृति के 2 बूँदें ड्रिप और फिर धीरे coverslip के किनारे पर शेष मात्रा (कुल 130 μL के) टपकाव द्वारा अच्छी तरह से भरने. यह महत्वपूर्ण है जल्दी से काम करने के लिए लेपित coverslip Corti के अंग की कुर्की आश्वासन. Explants के ऊष्मायन के लिए विच्छेदन की दीक्षा से, यह आमतौर पर एक अभ्यास ऑपरेटर के लिए 10 मिनट लगते हैं Corti अलगाव प्रक्रिया के इस अंग को पूरा.
इस प्रोटोकॉल में, हम भी सूक्ष्म Corti के अंग के सर्पिल किनारी से संवेदी उपकला के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. इस प्रक्रिया में, सर्पिल किनारी दूर संवेदी 28G का उपयोग उपकला से dissected है आधा विच्छेदन उपकरण के रूप में इंसुलिन सुई. माइक्रो अलग बालों की कोशिकाओं और उनके इसी समर्थन की कोशिकाओं (3 अंजीर) की पंक्तियों के परिणामस्वरूप होते हैं. पृथक संवेदी उपकला तो इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित सभ्य जा सकता है. इस अलगाव सूक्ष्म प्रक्रिया ऊतक आसपास 4 से संवेदी epithelia के enzymatic जुदाई की तुलना में किया जाना चाहिए. स्तनधारियों में, के रूप में अच्छी तरह के रूप में गैर - जैसे मुर्गी, पृथक तहखाने mesenchymal 4 कोशिकाओं से संवेदी epithelia के अलगाव में vestibular अंगों परिणामों के thermolysin पाचन स्तनधारी प्रजातियों. चूहे कोक्लीअ में, thermolysin अधिक से अधिक उपकला रिज के जुदाई, कम उपकला रिज और तहखाने झिल्ली से 5 के साथ संवेदी epithelia में पाचन का परिणाम है. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि cochlear संवेदी उपकला साथ mesenchymal कोशिकाओं के बिना लेपित प्लेटें करने के लिए संलग्न कर सकते हैं. जबकि दोनों यांत्रिक विधि सूक्ष्म अलगाव और सर्पिल किनारी से संवेदी epithelia की जुदाई में enzymatic पाचन विधि परिणाम, thermolysin पाचन अधिक सूक्ष्म अलग विच्छेदन के लाभ एक अपेक्षाकृत कम प्रोटोकॉल, सस्ता अभिकर्मकों, और संभवतः कम तनाव में शामिल पाचन की enzymatic प्रभाव के कारण explant. इसके अतिरिक्त, इस दृष्टिकोण में तहखाने झिल्ली बरकरार रह है, जो संवेदी उपकला की संस्कृति की थाली अनुलग्नक वृद्धि कर सकते हैं. इस विधि का नुकसान इस नाजुक विच्छेदन और संभावित संवेदी सूक्ष्म विच्छेदन से परिणामस्वरूप उपकला यांत्रिक क्षति के लिए कौशल विकसित करने की आवश्यकता शामिल हैं.
इस प्रक्रिया की उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में, हम भी के अंग के उपयोग का एक उदाहरण पेशCorti संस्कृतियों, explant संस्कृति में exogenous जीन की electroporation. electroporation ऊपर वर्णित प्रक्रिया Corti electroporation के अंग के पिछले विधियों पर आधारित है. विशेष रूप से, Zheng और गाओ (2000) Corti के अलग चूहा अंगों जहां explants electroporation के लिए जगह में आयोजित की जाती हैं agarose का एक ढाला नाली के द्वारा और फिर कोलेजन पर लेपित सीरम मुक्त 2 मध्यम में 8 अच्छी तरह LabTek स्लाइड मढ़वाया की electroporation का वर्णन. उनके दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि अंगों को इतनी उन्मुख होते हैं कि explants के शीर्ष सतहों कैथोड, जो सैद्धांतिक रूप से explant भर electroporated कोशिकाओं की एक भी वितरण में परिणाम चाहिए का सामना है. लेकिन हमारे हाथ में, विधि है कि हम इस प्रक्रिया का वर्णन पर सुधार क्योंकि Corti के अंग प्रक्रिया के दौरान coverslip करने के लिए चिपका रहे जिससे electroporation बाद explant के हेरफेर को कम करने. इसके अतिरिक्त, Corti के अंगों के एक उच्च प्रतिशत इस प्रस्तुत पद्धति का उपयोग करके coverslips से जुड़ी बने रहे. हमारी विधि जोन्स, एट अल (2006) जो Fugene 6 अभिकर्मक के अलावा electroporation के बाद जीन अभिव्यक्ति की दक्षता बढ़ाने के लिए उपयोग करता है से लिया है. जोन्स एट अल (2006) के प्रोटोकॉल में, अंगों electroporated Fugene 6 अभिकर्मक अभिकर्मक के 100 μL, और 6 मढ़वाया के साथ 5 मिनट के लिए incubated. हमारी विधि Fugene 6 अभिकर्मक 03:02 प्लास्मिड डीएनए है, जो हम empirically पाया न्यूनतम अंग विषाक्तता के साथ इष्टतम ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए अनुपात का उपयोग में अलग है. हम undiluted Fugene 6 अभिकर्मक का उपयोग नहीं, जो संस्कृतियों के लिए विषाक्तता में परिणाम कर सकते हैं. हमारे प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोड विन्यास, के रूप में के रूप में अच्छी तरह जोन्स एट अल (2006) या तो सर्पिल किनारी या संवेदी कैथोड की स्थिति पर निर्भर करता है उपकला में प्राथमिक जीन अभिव्यक्ति में, परिणाम है. यद्यपि वहाँ कैथोड दूर संस्कृति की तरफ DsRed सकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं, वहाँ ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के एक उच्च कैथोड को करीब एकाग्रता है. Corti explant के अंग के दोनों पक्षों में transgene की एक पूरी अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, वर्तमान बस inverting सुराग के द्वारा एक दूसरे पल्स ट्रेन के लिए उलट किया जा सकता है. प्रस्तुत Corti (अंजीर 5) के अंग भर transgene मजबूत अभिव्यक्ति में प्रोटोकॉल का परिणाम है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए Demêmes डेनिएल और डगलस Cotanche शुक्रिया अदा करना है और हमें Corti के अंग के अलगाव के लिए शिक्षण विधियों में उनके प्रयासों के लिए होगा. और मैथ्यू चना, जेसन Meeker, केन्द्र और मार्शल (शेरी लिन, उसके योगदान वीडियो एनीमेशन के लिए कलाकृति के लिए, इसके अतिरिक्त, हम इश्माएल electroporator इलेक्ट्रोड Stefanov - वैगनर इंजीनियरिंग के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं www.goodfightproductions.com वीडियो उत्पादन के लिए ). NIDCD से इस काम अनुदान (P30DC05209 MEEI रिसर्च सुनवाई के लिए कोर समर्थन; RO1DC007174 एज R03DC010065 पार्कर) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% Solution |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | made in mouse |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140-095 | Qualified |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5" |
| #11 Scalpel Blade | BD Biosciences | 372611 | |
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 10564-011 | High Glucose |
| Horse Serum | Invitrogen | 2605088 | Heat Inactivated |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | Irradiated |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | BD Biosciences | 329465 | U-100 28G½ |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11-815-091-001 | |
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific | 14-956-5A | |
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Reporter plasmid | Clontech Laboratories | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 |
| Electroporator | Bio-Rad | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
References
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