Summary
Эта процедура описывает метод для изоляции и культуре мышиных орган Корти с или без спирального лимба и нейронов спирального ганглия. Мы также продемонстрировать метод для выражения экзогенного гена-репортера в органе Корти эксплантатов путем электропорации.
Abstract
Во всех млекопитающих, сенсорного эпителия для прослушивания расположен вдоль спирали кортиева органа, который находится внутри раковины форме улитки внутреннего уха (рис. 1). Волосы клеток в развивающихся улитки, которые mechanosensory клеткам слуховой системы, выровнены в один ряд внутренних волосковых клеток и три (в базовых и средних оборотов) до четырех (в апикальной очередь) ряда внешних волосковых клеток , которые охватывают длина кортиева органа. Волосы клетки преобразовывать звук вызванных механические колебания базилярной мембраны в нервные импульсы, которые мозг может интерпретировать. Большинство случаев нейросенсорной потери слуха вызвано смерти или дисфункции кохлеарные волосковые клетки.
Все более важным инструментом в слуховом исследование изоляции и в лабораторных условиях культуру орган эксплантов 1,2,9. После выделения, эксплантов может быть использован несколькими способами, чтобы представить информацию о нормативной, аномальный, или терапевтических физиологии. Экспрессия генов, стереоцилий подвижность, клеточной и молекулярной биологии, а также биологических подходов для волос регенерации клеток являются примерами экспериментальных приложений органа эксплантов Корти.
Этот протокол описывает метод для изоляции и культуры орган Корти от новорожденных мышей. Сопровождающее видео включает ступенчатое направления для изоляции височной кости от мыши щенков, и последующей изоляции улитки, спиральной связки, и кортиева органа. После выделения, сенсорного эпителия могут быть покрыты и культивировали в пробирке в полном объеме, или, как еще расчлененный микро-изоляции, что не хватает спираль лимба и нейронов спирального ганглия. Используя этот метод, первичные эксплантаты может поддерживаться в течение 7-10 дней. В качестве примера полезности этой процедуры, орган Корти эксплантов будет электропорации с экзогенными DsRed гена-репортера. Этот метод обеспечивает улучшение по сравнению с другими опубликованными методами, поскольку она обеспечивает воспроизводимые, однозначным, и ступенчатого направления для изоляции, микродиссекции и первичной культуры кортиева органа.
Protocol
День 1. Стерилизация и покрытием из стекла покровные.
- Сухой стерилизовать покровные стекла микроскопа в автоклаве.
- Место стерилизовать покровные на две лунки предварительно стерилизованные четыре блюда и культуры клеток.
- Пальто покровные с 1:01 поли-L-орнитин и ламинин дополнена с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в течение ночи при температуре 4 ° C.
- 400 мкл поли-L-орнитин (0,01% раствор хранить при температуре 4 ° С)
- 400 мкл ламинин (50 мкг / мл маточного раствора, хранящихся в аликвоты при -20 ° С)
- 200 мкл ФБС (хранится в аликвоты при -20 ° С)
- Тепло-стерилизовать инструменты рассечение на ночь в 150 ° С инкубатор.
- Сделать культуральной среде, содержащей 10% сыворотки и 10 мг / мл ампициллина.
- 90 мл Дульбеко изменения Eagle среднего
- 5 мл ФБС (хранится в аликвоты при -20 ° С)
- 5 мл лошадиной сыворотки (хранится в аликвоты при -20 ° С)
- 10 мкл ампициллин (10 мг / мл маточного раствора хранить при температуре 4 ° С)
День 2. Выделение кортиева органа.
- Стерилизовать положительные капот рассечение потока.
- Включение УФ-светом в течение 20 минут
- спрей всех поверхностей с 70% этанола и подождать 5 минут перед использованием.
- Обезглавьте мыши щенка (P4) у основания большого затылочного отверстия использовании операционных ножницами.
- Коротко промойте голову в 10 см блюдо, содержащие 70% этанола.
- Удаление эпидермиса с помощью скальпеля лезвия.
- Открытое черепа вдоль стреловидного шва использованием лезвие скальпеля, а затем делятся пополам переднего мозга. Сохраните хвостового переднего мозга для дальнейшего вскрытия.
- Удаление переднего мозга, мозжечка и ствола мозга использовании тупого рассечения.
- Удалить височных костей (рис. 2А), погрузите их кратко в 70% этанола, и передавать их на 3 мм блюдо со стерильной HBSS.
- Использование щипцов, удалить булла и окружающие ткани из каменистой части височной кости.
- Найдите форму раковины улитки (рис. 2B) и отделить его от вестибулярной системы с помощью щипцов.
- На данном этапе развития, костного лабиринта не полностью кальцинированная и легко расчлененным использованием щипцов. Удалить из костного лабиринта улитки тщательного разделения, начиная с конца базальных и перемещение вершиной использованием щипцов.
- Связки спираль и придает кортиева органа спиральный по спирали Modiolus (рис. 2С). Осторожно снимите органа Корти, обеспечивая спиральной связки на крючок области базы с использованием щипцов и раскручивание его по мере продвижения к вершине.
- Начиная с основания, удалить спираль связки из органа Корти с помощью # 55 тонких щипцов (рис. 2D).
Микро-изоляции органа Корти сенсорного эпителия (опционально). - Удалить орган Корти крюк области базы с использованием двух ½ Шприцы с инсулином вв постоянно прикреплены U-100 28G ½ иглы, как щипцами.
- Начиная с вершиной, удалить спираль лимба от ряда внутренних волосковых клеток и приступить основанию (рис. 2E-F).
Покрытие орган Корти эксплантов - Удалить poly-L-ornithine/laminin/FBS решение от культуры скважин и добавить 130 мкл культуральной среды.
- Передача расчлененный орган Корти для покрытия покровного стекла в культуре хорошо, и ориентироваться эксплантов, так что реснички волосковые клетки вверх.
- Удалить среды в культуре и использовании 200 мкл пипетки. Убедитесь, что базилярная мембрана производит солидное контакт с покрытием покровного стекла.
- Аккуратно добавить 130 мкл питательной среды для органа Корти использованием 200 мл пипетки. Применяют две капли на поверхности органа Корти, а затем постепенно добавить оставшийся объем в сторону покровное. Убедитесь, что орган Корти не плавать в культуральной среде, но остается прикрепленной к покровным.
- Инкубируйте течение ночи при 37 ° С в присутствии 5% СО 2.
День 3. Электропорации репортер ген в культивируемые кортиева органа.
- Удалить культуральной среды от органов культуры Корти.
- Добавить 130 мкл H 2 O в течение 1 мин, а затем удаляются с помощью 200 мкл пипетки.
- Добавить 30 мкл DsRed репортера плазмиды (2 мг / мл H 2 O хранить при температуре -20 ° С).
- Advance электродов electroporator использованием микроманипулятора так что анодго катода по обе стороны от культуры.
- Генерация импульсов (27В, 30 мс, 10 импульсов), чтобы electroporate репортер гена в органе Корти культуры эксплантов.
- Дополнительно: обратная полярности импульсов для обеспечения электропорации трансгенов на обоих modiolar и спиральные связки стороны эксплантов.
- Подождите 5 минут.
- Добавить 130 мкл Fugene 6: раствор ДНК (3 части Fugene до 2 ДНК части). Это решение должно быть подготовлены до начала электропорации процедура (шаг 20) с использованием 3 мл круглым дном полистирола пробирке в ламинарном боксе. Для того, чтобы это решение:
- Добавить 2,4 мкл Opti-MEM (хранить при 4 ° С) в пробирке.
- Добавить 0,6 мкл Fugene 6 реагента (хранить при 4 ° С) в пробирке. Убедитесь в том, чтобы добавить Fugene непосредственно к Opti-MEM и избегать прямого контакта со сторонами пробирке.
- Vortex в течение 1 секунды.
- Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
- Добавить 2,0 мкл DsRed репортера плазмиды двухцепочечной ДНК (хранить при температуре -20 ° C при 100 ДНК мкг / мл H 2 O аликвоты).
- Vortex в течение 1 секунды.
- Инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 200 мкл культуральной среды.
- Vortex в течение 1 секунды.
- Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2.
- Добавьте 2 мл питательной среды для культуры и инкубировать в течение 37 ° C в течение 10 дней.
Представитель Результаты
Мы представляем метод изоляции органа Корти из перинатального мыши. Процедура может быть использована для мышей в возрасте 16-й день эмбрионального примерно до 6-й день послеродового, после чего костного лабиринта становится достаточно кальцинированная оказать рассечение громоздким. После кортиева органа рассеченные, это может быть покрытием и культивировали либо в полном объеме (рис. 3) или в виде микро-изолированных сенсорного эпителия (рис. 4). У нас есть дальнейшие представил технику, чтобы выразить экзогенных генов в культурной кортиева органа. Органотипической культура полезна для многих других видов обучения, такие как анализ орган Корти экспрессии генов использованием RT-PCR или гибридизация, орган Корти со-культуры со спиральными ганглиозных клеток или экзогенных стволовых клеток использованием микро-изоляции 3, или в пробирке анализ волос клеточной смерти и возрождения.
Рисунок 1. Поперечное сечение P4 мышиной кортиева органа. (А) сечением от базальный оборот улитки cryosectioned получена из P4 мыши иллюстрирует общую структуру мышиной улитки, описанных в данном протоколе. Скала СМИ граничит с связки спирали и полоска сосудистой боков, мембраны Рейснера а главно, спираль лимба медиально и книзу базальной мембраны. Поле указано регионе расширилась в B. (В) органа Корти расположена на верхней стороне базальной мембраны и включает в себя один ряд внутренних волосковых клеток, в три ряда внешних волосковых клеток, а также их опорных клеток. Пунктирная линия 1 показывает расположение вдоль базилярной мембраны, которая снимается в этот орган рассечение Корти. Пунктирная линия 2 показывает расположение вдоль базилярной мембраны, которая удаляется при микро-выделения. Зеленый цвет означает, иммуногистохимического маркировки кальбиндин, что этикетки межзубных клетки спирального лимба, кохлеарные волосковые клетки, нейроны спирального ганглия, а также клетки связки спирали и полоска сосудистой 7. DAPI маркировка ядер в синий цвет.
Рисунок 2. Орган рассечение Корти. Изображения из сопровождающих видео орган выделить рассечение Корти) улитки и вестибулярного аппарата расположены в изолированных височной кости (красный цвет), В) из костного лабиринта улитки, С) связки спирали и прилагается кортиева органа после удаления костного лабиринта, D) удаление спираль связки и полоски сосудистой (красный) из органа Корти, Е), микро-изоляции чувствительного эпителия из спирального лимба (красный), и F) изолированной спиральной лимба (слева) и сенсорного эпителия (справа).
Рисунок 3. Искусственный орган Корти эксплантов. DIC изображение, показывающее органКорти из P4 Atoh1-nGFP мышь, которая была изолирована, с гальваническим и культивировали в течение пяти дней, как описано. Эта мышь была генетически модифицированных таким образом, что клетки, которые экспрессируют про-волосковых клеток гена гомолога атональной 1 (Atoh1 ака Math1) имеют зеленый флуоресцентный белок, который локализуется в ядре 8. Органы Корти из этих мышей выставку ядерной этикетке GFP во всех ядрах клеток волос и, следовательно, позволяют легко визуализировать сенсорного эпителия использованием epifluorescent микроскопом. Относительно большая спиральная лимба можно увидеть сбоку от сенсорного эпителия. Мезенхимальные клетки, которые произошли из органа Корти мигрировали от эксплантов. Синяя метка ядерной DAPI.
Рисунок 4. Микро-изолированных сенсорного эпителия. Epifluorescent изображение, полученное с сенсорного эпителия, которые были изолированы от P4 мышиной органа Корти, как описано и культивировали в течение ночи. Микро-изолят затем фиксировали в 4% параформальдегида и обрабатываемых в immunolabeling миозина 7а, какие метки кохлеарные волосковые клетки. Обратите внимание на отсутствие сравнительно большие спиральные лимба из рисунка 3. Синяя метка ядерной DAPI.
Рисунок 5. Электропорации DsRed гена-репортера в культурной кортиева органа. Всего органами Корти с С-4 Atoh1-nGFP щенков мыши были изолированы, с гальваническим, а затем электропорации с DsRed гена-репортера, как описано, а затем рассматривается под микроскопом epifluorescent. Клетки органа Корти эксплантов, что выражается трансгенных белков DsRed репортер выставку красной флуоресценции и эндогенные клетки эпителия сенсорных выставки зеленого ядерной флуоресценции. Трансгенные клетки можно увидеть во всем спираль лимба и сенсорного эпителия.
Discussion
Есть несколько деталей, которые имеют решающее значение для успеха этой процедуры. Чем короче время от временной изоляции кости орган Корти инкубации, тем больше вероятность того, что органы будут приложить к покровным и привести к жизнеспособной культуры орган. Поэтому, важно ограничить количество времени между рассечение и размещения органов в инкубаторе. Выбор антибиотика также имеет решающее значение, так как многие антибиотики аминогликозидов являются ототоксичных и приведет к гибели клеток волос. Хотя желательно отказаться от использования антибиотиков в целом, это оставляет открытой возможность для загрязнения. Поэтому мы предлагаем использовать в 10 мкг / мл ампициллина, как правило, чтобы преодолеть возможные проблемы загрязнения.
Наиболее проблемных аспектов этого, и другие процедуры первичной культуре кортиева органа, является тенденция органов плавать с пластинами во время инкубации. Хотя плавающей культур органа могут оставаться жизнеспособными в течение 5-7 дней, Есть недостатки культивирования плавающей органов. Например, плавающая орган культур часто раза на себя через 4-5 дней оказания микроскопии проблематично. Впоследствии, структурную целостность органа может стать угрозой, по сравнению с органами, которые были прикреплены к покровным. Мы обнаружили, что следующие методы способствовать тому, чтобы орган Корти не плавать в культуральной среде, но остается прикрепленной к покровным. Во-первых, слой стекла покровные в 1:01 polyornithine / ламинин дополнена с 20% FBS, как описано. Инкубации в течение ночи, предусмотренных в данный протокол минимальное время, которое пластина должна быть покрыта. В нашей лаборатории, мы часто пальто все пластины, которые мы должны в течение одной недели и держать их при температуре 4 ° С до того дня, перед использованием, когда мы переместить их в инкубатор для инкубирования в течение ночи. Во-вторых, после того, органы транспортируются на покрытие покровные, ориентироваться эксплантов, так что реснички волосковых клеток лицевой стороной вверх. Это направление будет способствовать присоединение базилярной мембраны культуры блюдо. В-третьих, удаление информации в течение хорошо, чтобы прикрепить к эксплантов покрытием блюдо. Это позволит обеспечить контакт между блюдо культуры и базальной мембраны и повысить способность эксплантов придерживаться стекла. Это также поможет в поддержании структурной целостности рядов волосковых клеток. И наконец, осторожно капать по 2 капли культуральной среде на поверхности органа Корти использовании 200 мкл пипетки емкость, а затем медленно заполнить хорошо капает оставшийся объем (от общего объема 130 мкл) на стороне покровного стекла. Важно, чтобы работать быстро, чтобы обеспечить крепление органа Корти, чтобы покровное покрытие. С начала вскрытия для инкубации эксплантов, он обычно занимает 10 минут практикуется оператора для завершения этого органа процедуры изоляции Корти.
В этом протоколе, мы также представляем метод микро-изоляции чувствительного эпителия из спирального лимба из кортиева органа. В этой процедуре, спираль лимба рассечен подальше от чувствительного эпителия использованием 28G ½ инсулина иглы, как рассечение инструментов. В результате микро-изоляции состоит из рядов волосковых клеток и их соответствующие поддерживающие клетки (рис. 3). Изолированных сенсорного эпителия могут быть культивировали, как описано в данном протоколе. Этот микро-изоляции процедура должна быть по сравнению с ферментативной разделения сенсорного эпителия от окружающей ткани 4. У млекопитающих, а также не-млекопитающих, таких как куры, термолизин переваривания изолированы вестибулярный результаты органов в изоляции сенсорного эпителия из подвала мезенхимальных клеток 4. В крысы улитки, термолизин пищеварения приводит к разделению больше эпителиальных хребет, хребет меньшей эпителиальные и сопутствующие сенсорного эпителия от базальной мембраны 5. Тем не менее, неясно, является ли кохлеарный сенсорного эпителия можете прикрепить к пластинками, покрытыми без сопровождающих мезенхимальных клеток. Хотя и механических микро-изоляции методом и методом ферментативного результате пищеварения разделения сенсорного эпителия из спирального лимба, преимущества микро-изолировать рассечение над пищеварения термолизин включают относительно короткий протокол, более дешевые реагенты, и, возможно, меньше стресса для эксплантов из-за ферментативной эффекты пищеварения. Кроме того, базальной мембраны, остается без изменений в этом подходе, который может усилить крепление чувствительного эпителия к культуре пластины. Недостатки этого метода относится необходимость развития навыков в этой деликатной рассечение и потенциальных механических повреждений чувствительного эпителия в результате микро-рассечение.
В качестве примера полезности этой процедуры, мы также представляем один из примеров использования органаКорти культур; электропорации экзогенных генов в эксплантов культуры. Электропорации процедуре, описанной выше, основана на предыдущих методов орган электропорации Корти. Примечательно, что Чжэн и Гао (2000) описывают электропорации изолированных органов крыс Корти, где эксплантов удерживаются на месте для электропорации по формованных паз агарозы, а затем высевают на коллаген покрытием 8-а LabTek слайда в бессывороточной среде 2. Преимущество их подхода является то, что органы ориентированы так, что верхние поверхности эксплантатов лицо катода, что теоретически должно привести к равномерному распределению электропорации клеток через эксплантов. В наших руках однако, метод, который мы описываем усовершенствовали эту процедуру, поскольку орган Корти остались прикреплены к покровным на протяжении всей процедуры таким образом уменьшая манипуляции эксплантов после электропорации. Кроме того, высокий процент органов Корти остались прикреплены к покровные использовании этого метода представлено. Наш метод взят из Jones и соавт. (2006), который использует добавление Fugene 6 реагентов для повышения эффективности экспрессии генов после электропорации. В Jones и соавт. (2006) протокол, органы электропорации, инкубировали в течение 5 минут с 100 мкл Fugene 6 трансфекции реагентом, а также покрытием 6. Наш метод отличается тем, использование 3:02 отношение Fugene 6 реагента плазмидной ДНК, который мы нашли эмпирически, чтобы обеспечить оптимальную трансгенной экспрессии с минимальной токсичностью орган. Мы не используем неразбавленном Fugene 6 реагента, который может привести к токсичности для культуры. Конфигурации электродов в нашем протоколе, а также Jones и соавт. (2006), приводит к первичной экспрессии генов в любом спираль лимба или сенсорного эпителия в зависимости от положения катода. Хотя Есть DsRed положительных клеток на стороне культуры далекого к катоду, существует более высокая концентрация трансгенных клеток ближе к катоду. Чтобы обеспечить полное выражение трансгена в обе стороны органа Корти эксплантов, ток может быть отменено для второй серии импульсов простым обращением ведет. Представлен протокол результатов в прочном выражение трансгенов всей органа Корти (рис. 5).
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Demêmes Даниэль и Дуглас Cotanche и за их усилия в обучении нами методов выделения из кортиева органа. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Измаила Стефанов-Wagner для инженерных electroporator электродов; Шерри Лин ей способствующих обложки к видео-анимация; и Мэтью Хана, Джейсон Микер, и Кендра Маршалл ( www.goodfightproductions.com ) для производства видео. Эта работа финансировалась за счет грантов (R03DC010065-Паркер; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI каркас для Слушания исследований) от NIDCD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% Solution |
| Laminin | BD Biosciences | 354232 | made in mouse |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140-095 | Qualified |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5" |
| #11 Scalpel Blade | BD Biosciences | 372611 | |
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen | 10564-011 | High Glucose |
| Horse Serum | Invitrogen | 2605088 | Heat Inactivated |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | Irradiated |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | BD Biosciences | 329465 | U-100 28G½ |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche Group | 11-815-091-001 | |
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific | 14-956-5A | |
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Reporter plasmid | Clontech Laboratories | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 |
| Electroporator | Bio-Rad | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
References
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture. Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).
- Martinez-Monedero, R. THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR. J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).
- Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles. Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).
- Zhang, Y. Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).
- Jones, J. M. Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti. J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).
- Daniela, B., Josef, S. Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice. The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).
- Helms, A. W. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).
- Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures. European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).
