Biology

Encapsulation PuraMatrix de células de câncer

Published: December 17, 2009 doi: 10.3791/1692

Adnan O. Abu-Yousif¹, Imran Rizvi^1,2, Conor L. Evans¹, Jonathan P. Celli¹, Tayyaba Hasan^1,3

¹Wellman Center for Photomedicine Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Thayer School of Engineering, Dartmouth College, ³Department of Dermatology, Harvard Medical School

Summary

Este vídeo demonstra como para encapsular e células cancerosas em cultura PuraMatrix, um auto comercialmente disponíveis montagem gel peptídeo.

Abstract

Crescente evidência sugere que as células cancerosas cultura em três dimensões com mais precisão recapitula a complexidade da biologia tumoral. Muitos destes modelos utilizam membrana basal reconstituída derivados de animais que contêm uma quantidade variável de fatores de crescimento e citocinas que podem influenciar o crescimento desses modelos de cultura de células. Aqui, descrevemos em detalhes a preparação eo uso de PuraMatrix, um disponível comercialmente auto gel montagem peptídeo que é desprovido de materiais de origem animal e patógenos para encapsular e propagar a linha de células de câncer de ovário, OVCAR-5. Começamos por descrever como preparar o PuraMatrix antes do uso. Em seguida, demonstrar como misturar corretamente o PuraMatrix e suspensão de células para encapsular as células do hidrogel. Após a adição de meios de cultura celular ou injeção em um ambiente fisiológico, o componente de peptídeo PuraMatrix rapidamente auto monta em um hidrogel 3D que exibe um nanômetro estrutura fibrosa escala com um tamanho médio dos poros de 500-200 nm

Protocol

Notas técnicas:

Gelificação é iniciada pela adição de sais. Portanto, é fundamental que não sais de entrar em contato com PuraMatrix até gelificação é desejado; exposição a sais de muito baixa força iônica (eg, <0,05 M) fará com que gelificação irreversível.
Soluções estoque restante que está preparado pode ser usado em uma data posterior, desde que não tenham entrado em contato com sais. Você não precisa se preocupar com sonicação repetir.
Bolhas de ar podem ser removidas PuraMatrix alíquotas em tubos estéreis, seguido por centrifugação.
Tenha muito cuidado durante as mudanças de mídia como aspiração podem facilmente perturbar a cama PuraMatrix.

Materiais:

BD PuraMatrix Peptide Hydrogel RAD16-1% (Cat # 354250): A concentração de peptídeo total da mistura não diluída é de 10 mg / ml.

Sonicador água Banheira ou Vortex
De 96 poços prato de cultura de células
Meios de Cultura de células
Estéril Filtrado H ₂ O
Sacarose filtrado estéril 20%
Células (todos menos 5.000 células / poço): OVCAR-5

Todos os passos devem ser realizados sob condições assépticas.

Procedimento:

Sonicate o PuraMatrix 1% (RAD16) em um sonicador banho-maria durante 30 minutos para reduzir a viscosidade antes do uso.
A solução PuraMatrix 1% pode agora ser aliquotado em tubos estéreis a simplificar experiências futuras.
1. Evitar a formação de bolhas de ar, se elas formam simplesmente girar os tubos estéreis, contendo PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) por 5 minutos.
2. A concentração de peptídeo total da mistura não diluída é de 10 mg / ml.
Dois conjuntos de quatro poços serão banhados em 2,5 mg / ml e 1,25 mg / ml de concentração de peptídeo total, respectivamente.
Diluir o PuraMatrix em cada bem definido com 0,2 m estéril filtrado sacarose 20% e sacarose 13,3% para concentrações totais de peptídeo de 5 mg / ml e 2,5 mg / ml, respectivamente, para alcançar uma concentração 2x de BD PuraMatrix em sacarose 10%.
1. Fazer sacarose 20%, diluir 10 g de sacarose, em seguida, o volume a 50 ml de água.
2. 13% de sacarose e 10% podem ser preparadas por diluição da solução estoque de 20%.
  1. 13% de sacarose (para cada 10 ml): 6,5 ml de sacarose 20% + 3,5 ml estéril H ₂ O.
  2. 10% Sacarose (para cada 10 ml): 5,0 ml de sacarose 20% + 5,0 ml estéril H ₂ O.
Prepare uma mistura mestre de peptídeo PuraMatrix com base no número de poços que pretende prato. (Veja o exemplo abaixo.) Então alíquotas em tubos individuais contendo 25 ml da mistura de mestre.
1. O master mix deve ser preparado com o dobro da concentração final desejada de peptídeo total como ele vai ser diluído com igual volume de células durante a galvanização.
Preparar suspensões de células por trypsinizing culturas de células de células em monocamada.
1. 2 ml de 0,05% Tripsina EDTA pode ser usado para cada Flask T-75.
Neutralizar a tripsina com a adição de meios de cultura celular contendo 10% de calor soro fetal bovino inativado (uso pelo menos 2 ml de mídia por ml de tripsina usada na etapa anterior.)
Centrifugar as células a 1000 rpm (~ 300 xg) por 5 minutos para criar um pellet de células.
1. Ressuspender as células em 10% de sacarose estéril filtrado.
2. Contar as células e spin para baixo novamente a 1000 rpm (~ 300 xg) por 5 minutos para remover traços de sal encontrados na mídia.
Ressuspender as células OVCAR-5 em sacarose 10% a 2.0 x 10 ⁵ células / ml para que a contagem de células por poço finais serão 5.000 células em cada poço.

Os seguintes passos devem ser realizados rapidamente.
Adicionar 25 mL do 2,0 x 10 ⁵ células / ml de suspensão para o primeiro tubo contendo 25 mL individuais do mix de mestre de PuraMatrix como mostrado no esquema acima.
1. Rapidamente mix por pipetagem (~ 5 vezes para cima e para baixo) no tubo sem a introdução de bolhas de ar.
2. Em seguida, pipetar 50 ul da célula mistura suspensão / PuraMatrix no poço apropriado de um prato de 96 poços.
3. Iniciar a gelificação do PuraMatrix BD com cuidado pipetando 150 media de células mL de cultura (RPMI + 10% FBS) para o lado do bem
Repita os passos descritos no 8 até que todos os poços foram banhados.
Depois de 30 minutos Muito Remova cuidadosamente ~ 2 / 3 dos meios de comunicação utilizando uma pipeta 200 mL para equilibrar o pH do hidrogel.
1. NÃO USE A aspirador a vácuo como isso irá interromper o MATRIX
2. Coloque a ponta da pipeta no poço, para queele não toque na cama PuraMatrix e delicadamente remova a mídia do poço.
3. Cuidados devem ser tomados para não perturbar a matriz durante a cultura de células em PuraMatrix.
Muito delicadamente adicionar 150 mL de meio de cultura de células frescas ao lado das células que contêm bem encapsulado em PuraMatrix.
Alterar a mídia de cultura de células em cada poço a cada 48 horas, com meios de cultura fresco com cuidado repetindo os passos 10 e 11.

Resultados representativos:

Figura 1. OVCAR-5 células foram encapsulados como descrito no protocolo acima. Imagens foram adquiridas usando uma invertida Olympus FV1000 microscópio equipado com Ti-DeepSee Spectra Physics: Sapphire a laser ajustado para 750 nm. Sessões de imagem foram realizados nos dias 1, 3, 5 e 7 pós-plating. A longa distância de trabalho de água, mergulhando objetiva de 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) foi usado para a imagem através da PuraMatrix. Volumes tridimensionais foram coletados através da aquisição de pilhas de imagens em 1,47 mM passos axial. Duas organizações não-descanned detectores coletados a emissão autofluorescência utilizando violeta (440-490 nm) e verde (510-550 nm) filtros passa-banda. As imagens finais e filmes pilha de profundidade foram processadas utilizando ImageJ, combinando ambos os canais de detecção. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.