Summary
Dieses Video zeigt, wie Sie kapseln und Kultur Krebszellen in PuraMatrix, ein im Handel erhältliches Selbstmontage Peptid-Gel.
Abstract
Zunehmende Hinweise darauf, dass Kultivierung von Krebszellen in drei Dimensionen genauer rekapituliert die Komplexität der Tumorbiologie. Viele dieser Modelle verwenden rekonstituierte Basalmembran von Tieren, die eine variable Menge von Wachstumsfaktoren und Zytokine, die das Wachstum dieser Zellkultur-Modellen beeinflussen können enthalten abgeleitet. Hier beschreiben wir im Detail die Herstellung und Verwendung von PuraMatrix, ein im Handel erhältliches Selbstmontage Peptid-Gel, das frei von tierischen Materialien und Erregern zu kapseln und zu propagieren Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR-5 ist. Wir beginnen mit einer Beschreibung, wie die PuraMatrix vor vorbereiten zu bedienen. Als nächstes zeigen wir, wie man richtig mischen PuraMatrix und Zellsuspension zu den Zellen in das Hydrogel kapseln. Nach der Zugabe von Zellkulturmedien oder Injektion in einer physiologischen Umgebung, die Peptid-Komponente von PuraMatrix schnell selbst montiert in ein 3D-Hydrogel, das im Nanometer-Maßstab faserige Struktur mit einer mittleren Porengröße von 5-200 nm aufweist
Protocol
Technische Hinweise:
- Die Gelierung wird durch die Zugabe von Salzen initiiert. Daher ist es entscheidend, dass keine Salze in Kontakt mit PuraMatrix kommen, bis Gelierung gewünscht wird; Exposition gegenüber Salzen sehr niedriger Ionenstärke (zB <0,05 M) wird irreversiblen Gelierung führen.
- Restbestände Lösungen, die bereit sind, können zu einem späteren Zeitpunkt, sofern sie nicht in Kontakt mit Salzen kommen, verwendet werden. Sie brauchen nicht zu wiederholen, Beschallung sorgen.
- Luftblasen entfernt Aliquotierung PuraMatrix in sterilen Röhrchen durch Zentrifugation gefolgt werden.
- Seien Sie sehr vorsichtig bei der Medien ändert sich wie Aspiration leicht stören können die PuraMatrix Bett.
Materialien:
BD PuraMatrix RAD16 Peptide Hydrogel-1% (Kat. Nr. 354250): Die gesamte Peptid-Konzentration der unverdünnten Mischung 10 mg / ml.
- Wasser Ultraschallbad oder Vortex
- 96-well Zellkulturschale
- Zellkulturmedien
- Sterilfiltriert H 2 O
- Steriles gefiltertes 20% Saccharose
- Cells (alle bei 5.000 Zellen / Well): OVCAR-5
Alle Schritte müssen unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.
Vorgehensweise:
- Mit Ultraschall die 1%-PuraMatrix (RAD16) in einem Wasserbad Sonicator für 30 Minuten, um die Viskosität vor zu reduzieren, um zu verwenden.
- Die 1% PuraMatrix Lösung kann nun in sterilen Röhrchen aliquotiert werden, um zukünftige Experimente zu vereinfachen.
- Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, wenn sie bilden einfach Spin-Down der sterilen Röhrchen PuraMatrix bei 1000 rpm (300 xg) für 5 Minuten.
- Die gesamte Peptid-Konzentration der unverdünnten Mischung 10 mg / ml.
- Zwei Sätze von 4 Bohrungen werden auf 2,5 mg / ml und 1,25 mg / ml Gesamt-Peptid-Konzentration bzw. beschichtet werden.
- Verdünnen Sie die PuraMatrix in jede Vertiefung mit 0,2 mu m sterilfiltriert 20% Saccharose und 13,3% Saccharose zu insgesamt Peptid-Konzentrationen von 5 mg / ml und 2,5 mg / ml eingestellt, jeweils mit einer Konzentration von 2x BD PuraMatrix in 10% Saccharose zu erreichen.
- To Make 20% Saccharose, verdünnte 10 g Saccharose, dann ein Volumen von 50 ml Wasser.
- 13% und 10% Saccharose kann durch Verdünnen der 20% Stammlösung hergestellt werden.
- 13% Saccharose (je 10 ml): 6,5 ml 20% Saccharose + 3,5 ml sterilem H 2 O.
- 10% Saccharose (je 10 ml): 5,0 ml 20% Saccharose + 5,0 ml sterilem H 2 O.
- Bereiten Sie einen Master-Mix von PuraMatrix Peptids auf die Anzahl der Bohrlöcher Sie beabsichtigen, Platte basiert. (Siehe Beispiel unten.) Dann Aliquot in einzelne Röhrchen mit 25 ml des Master-Mix.
- Der Master-Mix sollte auf das Doppelte der gewünschten Endkonzentration von insgesamt Peptid hergestellt werden, wie es mit dem gleichen Volumen von Zellen während der Beschichtung verdünnt werden.
- Der Master-Mix sollte auf das Doppelte der gewünschten Endkonzentration von insgesamt Peptid hergestellt werden, wie es mit dem gleichen Volumen von Zellen während der Beschichtung verdünnt werden.
- Bereiten Zellsuspensionen von trypsinizing Zellmonolayer Zellkulturen.
- 2 ml 0,05% Trypsin EDTA kann für jede T-75 Fläschchen verwendet werden.
- Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von Zellkulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Rinderserum (mind. 2 ml Medium pro ml Trypsin in den vorherigen Schritt.)
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 rpm (~ 300 xg) für 5 Minuten, um sich ein Zellpellet zu schaffen.
- Resuspendieren der Zellen in 10% sterilfiltriert Saccharose.
- Zählen Sie die Zellen und Spin-down wieder bei 1000 Umdrehungen pro Minute (~ 300 xg) für 5 Minuten, um Spuren von Salz in den Medien gefunden zu entfernen.
- Resuspendieren OVCAR-5-Zellen in 10% Saccharose bei 2,0 x 10 5 Zellen / ml, so dass die endgültige Zellzahl pro Well werden 5.000 Zellen werden in jede Vertiefung.
Die folgenden Schritte sollten zügig durchgeführt werden. - Add 25 ul des 2,0 x 10 5 Zellen / ml Suspension zum ersten Individuum Röhrchen mit 25 ul des Master-Mix aus PuraMatrix wie in den oben schematisch dargestellt.
- Schnell durch Pipettieren (~ 5 mal rauf und runter) Mischung in die Röhre, ohne dabei Luftblasen.
- Dann Pipette die 50 ul Zellsuspension / PuraMatrix Mischung in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Schale.
- Initiieren Gelierung der BD PuraMatrix durch vorsichtiges Pipettieren 150 ul Zellkulturmedien (RPMI + 10% FBS) an der Seite des Brunnens
- Wiederholen Sie die Schritte in 8 dargestellt, bis alle Vertiefungen haben vergoldet worden.
- Nach 30 Minuten ganz sanft zu entfernen ~ 2 / 3 der Medien mit einer 200 ul Pipette auf den pH-Wert des Hydrogels Gleichgewicht zu bringen.
- DO NOT USE A VACUUM Aspirator AS THIS THE MATRIX gestört werden
- Setzen Sie die Pipettenspitze in den Brunnen, so dasses berührt nicht die PuraMatrix Bett und entfernen Sie vorsichtig Medien aus dem Brunnen.
- Es sollte darauf geachtet werden, nicht stören die Matrix während der Kultivierung von Zellen in PuraMatrix werden.
- Sehr vorsichtig Fügen Sie 150 ml frisches Zellkulturmedium auf der Seite der auch mit mehreren Zellen in PuraMatrix gekapselt.
- Ändern Sie den Zellkulturmedien in jede Vertiefung alle 48 Stunden mit frischem Kulturmedium durch vorsichtiges Wiederholung der Schritte 10 und 11.
Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. OVCAR-5-Zellen eingekapselt wie in dem oben beschriebenen Protokoll. Die Bilder wurden mit einem inversen Olympus FV1000 Mikroskop mit Spectra-Physics DeepSee Ti ausgestattet: Saphir-Lasers abgestimmt, um 750 nm. Imaging-Sitzungen wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 post-Beschichtung durchgeführt. Ein langer Arbeitsabstand, Wasser getaucht 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) wurde zu Bild durch die PuraMatrix verwendet. Dreidimensionale Volumina wurden durch den Erwerb von Bildstapel in 1,47 um axiale Schritte gesammelt. Zwei nicht-descanned Detektoren gesammelt die Autofluoreszenz-Emission mit Violett (440-490 nm) und Grün (510-550 nm) Bandpass-Filter. Die endgültigen Bilder und Tiefe Stapel Filme wurden unter Verwendung ImageJ durch die Kombination beider Detektionskanäle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
