Biology

Kanser Hücrelerinin PuraMatrix Kapsülleme

Published: December 17, 2009 doi: 10.3791/1692

Adnan O. Abu-Yousif¹, Imran Rizvi^1,2, Conor L. Evans¹, Jonathan P. Celli¹, Tayyaba Hasan^1,3

¹Wellman Center for Photomedicine Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Thayer School of Engineering, Dartmouth College, ³Department of Dermatology, Harvard Medical School

Summary

Bu video PuraMatrix, peptid jel montaj piyasada bulunan kendini saklanması ve kültür kanser hücrelerinin nasıl gösteriyor.

Abstract

Artan kanıtlar özetlediği karmaşıklığı tümör biyolojisi daha doğru bir şekilde üç boyutlu olarak bu kültür kanser hücrelerinin önerir. Bu modellerin çoğu, bu hücre kültürü modelleri büyümesini etkileyebilir büyüme faktörleri ve sitokinler değişebilen miktarda içerir hayvanlardan elde edilen sulandırılmış bazal membran kullanır. Burada, ayrıntılı olarak tarif PuraMatrix, hayvansal kaynaklı malzeme ve yumurtalık kanseri hücre hattı, OVCAR-5 saklanması ve yaymak için patojenler yoksun bir piyasada mevcut kendinden montaj peptid jel hazırlanması ve kullanılması. Biz kullanmadan önce PuraMatrix nasıl hazırlanacağını açıklayan başlar. Sonra, hidrojel hücrelerin düzgün kapsüllemek PuraMatrix ve hücre süspansiyonu karıştırmak için nasıl göstermektedir. Ayrıca, fizyolojik bir ortama hücre kültür ortamı veya enjeksiyon üzerine, PuraMatrix peptit bileşeni hızla kendini 500-200 nm ortalama gözenek boyutu ile nanometre ölçekli lifli yapısı sergiler 3D hidrojel içine toplanır

Protocol

Teknik Notlar:

Katılaşma, tuz ilavesi ile başlatılır. Bu nedenle, jelleşme istenilen kadar hiçbir tuzları PuraMatrix ile temas geldiğini KRİTİK çok düşük iyonik kuvvet tuzları (örneğin, <0.05 M) maruz kalma, geri dönüşü olmayan jelleşme neden olacaktır.
Tuzları ile temas gelmeyecek daha sonraki bir tarihte hazırlanan kalan stok solüsyonları kullanılabilir. Tekrar sonication hakkında endişelenmenize gerek yoktur.
Hava kabarcıkları santrifüj yoluyla takip steril tüpler içine PuraMatrix aliquoting silinebilir.
Aspirasyon PuraMatrix yatağına kolayca bozabilir medya değişimleri sırasında çok dikkatli olun.

Malzemeler:

BD PuraMatrix RAD16 Peptid Hidrojel% 1 (Cat # 354.250): sulandırılmamış karışımı toplam peptid konsantrasyonu 10 mg / ml.

Su Banyosu sonikatör veya Vortex
96-well hücre kültürü çanak
Hücre Kültürü Ortamı
Steril Filtreli H ₂ O
Steril Filtreli% 20 Sakkaroz
Hücreler (5.000 hücreleri /): OVCAR-5

Tüm adımları aseptik koşullar altında yapılmalıdır.

Prosedür:

Kullanmadan önce viskoziteyi azaltmak için, 30 dakika süreyle su banyosunda sonikatör% 1 PuraMatrix (RAD16) sonikasyon.
% 1 PuraMatrix çözüm gelecek deneyler basitleştirmek için steril tüpler içine aliquoted olabilir.
1. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek, onlar formu sadece 5 dakika 1000 rpm (300 xg) PuraMatrix içeren steril tüpler aşağı doğru döndürün.
2. Sulandırılmamış karışımının toplam peptid konsantrasyonu 10 mg / ml.
İki setleri sırasıyla 2.5 mg / ml ve 1.25 mg / ml toplam peptid konsantrasyonu, 4 kuyu kaplama olacak.
Sırasıyla,% 10 sakaroz BD PuraMatrix 2x konsantrasyonu elde etmek için de 0.2 mikron toplam peptid konsantrasyonları 5 mg / ml ve 2.5 mg / ml filtrelenmiş steril% 20 ve% 13.3 sakkaroz sakaroz her PuraMatrix sulandırınız.
1. % 20 sukroz olun, sonra 10 g sakaroz, hacim, 50 ml su ile seyreltilmiş.
2. % 13 ve% 10 sakkaroz,% 20 stok solüsyonu seyreltilmesi ile hazırlanabilir.
  1. % 13 Sakkaroz (her 10 ml için): 6.5 ml% 20 sukroz + 3.5 ml steril H ₂ O.
  2. % 10 Sakkaroz (her 10 ml için): 5.0 ml% 20 sukroz + 5.0 ml steril H ₂ O.
PuraMatrix peptid plaka niyetinde kuyu sayısı dayalı bir master karışımı hazırlayın. (Aşağıdaki örneğe bakın.) Daha sonra 25 ml ana karışımı içeren bireysel tüpler içine kısım.
1. Kaplama sırasında hücrelerin eşit hacmi ile seyreltilmiş olacak gibi ana karışımı, toplam peptid iki kez istenen nihai konsantrasyonu hazırlanmalıdır.
Hücre tek tabakalı hücre kültürleri trypsinizing, hücre süspansiyonları hazırlayın.
1. 2 ml% 0.05 tripsin EDTA her T-75 Flask için kullanılabilir.
Tripsin ilavesi ile% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (önceki adımda kullanılan tripsin ml başına medya en az 2 ml.) Içeren hücre kültür ortamı nötralize
Pelet bir hücre oluşturmak için 5 dakika için 1000 rpm (~ 300 xg) hücreler santrifüjleyin.
1. % 10 steril süzülmüş sakaroz hücrelerin tekrar
2. Hücre sayımı ve medya bulunan eser miktarda tuz kaldırmak için 5 dakika 1000 rpm (~ 300 xg) tekrar aşağı doğru döndürün.
De başına nihai hücre sayısı her kuyuda 5.000 hücreler olacağı ⁵ hücre / ml, 2.0 x 10% 10 sakaroz OVCAR-5 hücreleri tekrar

Aşağıdaki adımları hızla yapılmalıdır.
2.0 x 10 ⁵ hücre / ml süspansiyon 25 ul 25 ul PuraMatrix Yukarıdaki şemadan görüldüğü gibi ana karışımı içeren ilk kişisel tüp ekleyin.
1. Hızla olmadan tüp içinde hava kabarcıkları tanıtan pipetleme (yukarı ve aşağı ~ 5 kez) karıştırın.
2. Sonra, 96 iyi bir çanak uygun kuyuya 50 ul hücre süspansiyonu / PuraMatrix karışımı pipetle.
3. Iyi tarafı hafifçe 150 ul hücre kültür ortamı (RPMI +% 10 FBS) pipetleme BD PuraMatrix jelleşme başlatın
Tüm kuyuları kaplama kadar 8 özetlenen adımları tekrarlayın.
30 dakika sonra çok yavaşça hidrojel pH denge sağlaması için 200 ul pipet kullanarak medya ~ 2 / 3 kaldırmak.
1. BU MATRIX bozacak AS VAKUM ASPIRATOR KULLANMAYIN
2. Böylece iyi pipet ucu yerleştirin .PuraMatrix yatağından hafifçe dokunmak ve iyi medya kaldırmak değildir.
3. Bakım PuraMatrix hücrelerin kültür sırasında matris bozmayacak alınmalıdır.
Çok yavaşça PuraMatrix kapsüllenmiş içeren hücrelerin yan 150 ul taze hücre kültür ortamı ekleyin.
10. ve 11. adımları dikkatlice tekrar ederek taze kültür ortamı ile her 48 saatte bir hücre kültür ortamı değiştirin.

Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 OVCAR-5 hücrelerin, yukarıda protokol açıklandığı gibi kapsüllü . Sapphire lazer 750 nm ayarlanmış: Görüntüler Spectra-Fizik DeepSee Ti ile donatılmış bir ters Olympus FV1000 mikroskop kullanılarak elde edildi. Görüntüleme oturumları gün 1, 3, 5 ve 7 post-kaplama yapılmıştır. 40x objektif daldırma bir uzun çalışma mesafesi, su (Olympus LUMPLFLN 0.8 NA) PuraMatrix üzerinden görüntü için kullanılır oldu. 1.47 mikron eksenel adımları görüntü yığınlarının satın alarak üç boyutlu birimler toplandı. Olmayan iki descanned dedektörleri otofloresans emisyon menekşe (440-490 nm) ve yeşil (510-550 nm) bant geçiren filtreler kullanılarak toplanmıştır. Son görüntüleri ve derinlik yığını filmleri her iki algılama kanallarını birleştirerek ImageJ kullanılarak işlendi. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .