자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

Summary

6 잘 판의 공간 및 시간적 산소 이상의 향상된 제어를 제공하는 추가 기능에 대한 플랫폼의 제작 및 검증. 이 디바이스는 문화 시스템의 숫자로 적용할 수 있으며, 상처의 치유에 대한 산소의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

산소는 많은 세포 통로의 핵심 모듈 레이터이지만, 현재의 장치가 좋으면

Protocol

1. 장치 기능

1. hypoxic 삽입 장치는 6 기둥을 포함하는 표준 6 자 플레이트로 둥지. 가스 기둥의 바닥에 microfluidic 네트워크를 통해, 기둥으로 흐르고, 밖 장치의 뒤로 흐르고 있습니다. microchannel 하단의 장벽을 형성 기둥의 기지에서 microchannel 가스와 문화 미디어 사이의 산소 확산을 허용 100 μm의 두께 가스 투과 PDMS 막입니다. 따라서 장치가 원하는 가치를 향한 미디어 산소 농도를 드라이브 농도 기울기를 설립하여 운영하고 있습니다.
2. 장치가 hypoxic 챔버 및 기타 세포 산소 시스템 이상의 장점을 다수 제공합니다 : 1 건)) 빠른 시간적 제어, 2 허용 산소 확산 경로를 최소화 기둥 microchannel 디자인, 3과 같은 종속 산소 이상의 공간적 제어) 향상을 가지고 작은 연구실 풋프린트 및 실험 효율성을 높이기 위해 높은 처리량, 그리고 4) 전문 지식과 장비에 대한 요구하지 않고 일반 세포 배양 도구 (예 : multiwell 판)에 적응.

2. 장치 제조

1. 먼저 기둥 배열은 이전에 가공 Delran 금형의 PDMS와 몰드 복제됩니다.
2. 가스 다음 각 기둥의 하단에 microchannel 표준 SU - 8 석판술 및 PDMS 복제 성형을 사용하여 조작합니다.
3. 가스 투과 막은 원하는 두께를 달성하기 위해 실리콘 웨이퍼에 대한 PDMS의 정의 회전에 의해 조작됩니다. 이 예제에서는 10 초 500 RPM 후 30 초 동안 900 rpm을 회전하여 가짜란 100 μm의 두꺼운 막이를 사용합니다.
4. 모든 구성 요소는 휴대용 플라즈마 장치 (모델 BD - 20, 전자 기술 제품)와 산소 플라즈마 처리 후 함께 보세 있습니다.

3. 장치 설정

1. 부드럽게 장치는 거품을 방지해야하고, 접시에 넣습니다. 삽입하는 동안 장치 앵글링하면 한쪽 거품을 추방하는 데 도움이됩니다. 실제 세포 기반 실험의 경우,이 단계는 살균 층류 후드 안에 완료해야합니다. 장치가 삽입되면 오염에 대한 가능성이 크게 감소, 조립이되지 않은 멸균 환경에서 보육에 이월 수 있도록.
2. 소스 가스 탱크에서 장치의 입구와 출구 포트에 튜브를 연결합니다. 세포 기반 실험, 문화 인큐베이터는 튜브 항목과 튜브는 장치를 휴대하고 인큐베이터에 넣어 후에 연결되어 있어야합니다을 허용하는 구멍이 있어야합니다. 기본 세포를 부술 정도로 PDMS를 변형 할 수있는 장치에 과도한 압박을 가하고 않도록주의하십시오.
3. 정밀 유량 조절이 장치를 넘쳐 방지하기 위해 탱크 톱 조절기를 열기 전에 닫혀 있는지 확인하십시오. 가스의 흐름을 시작합니다. 원하는 유속 (50-100 ML / 분)로 부드럽게 열고 정밀 유량 조절기. 시스템이 유속을 변경, equilibrates 동안 압력 강하의 변화하므로, 다음 시간 동안 밀접하게 가치를보고하고 필요에 따라 조정합니다. 미디어의 거품 형성을 방지하기 위하여, 높은 유량과 초기 십오분 평균 기간 이후 10-20 사이 ML / 분에 유량을 줄일 수 있습니다.
4. 원하는 실험 기간 후, 가스 흐름을 중단 접시를 제거하고, 프로세스 세포 그에 따라 (예 : 등, 개수, 얼룩, lyse).

4. 장치 확인

1. 보정
   1. 형광 산소의 위치의 번호와 위치를 선택하십시오
      산소 측정에 사용됩니다 (폭시) 센서 슬라이드 (정품 확인 요구 사항에 따라). 슬라이드 산소에 의해 침묵하는 형광 루테늄 염료의 코팅이 포함되어 있습니다.
   2. 0, 10 슬라이드 직접 노출하고, 가스 탱크에서 21 %의 산소와 적절한 평균 5 분 후에 이미지를 캡처합니다.
   3. 형광 강도에 따라 각 위치와 플롯 산소 농도에 대한 의미 이미지 강도를 내보냅니다.
   4. 00~10% 라인 피팅 선형 곡선과 10~21% 라인에 의해 보정 곡선을 생성합니다.
2. 이질
   1. 정의된 간격 (예 : 모든 1mm)에서 채널의 넓이를 걸치는 여러 지점을 설정합니다. 간격에 따라 이미지의 중복이있을 수 있습니다.
   2. 장치를 통해 잘 표면에서 산소 농도를 측정
3. 평균
   1. 산소 농도를 측정할 수있는 매력적 슬라이드에 세 개의 지점을 선택합니다.
   2. 즉시 주위 산소 수준에서 첫 이미지를 캡처 후 장치에 가스 흐름을 시작 정밀 유량 조절기를 엽니다. 산소 concentr의 기간과 정도를 평가하기 위해 적절한 간격으로 이미지를 캡처에이션의 평균 (30 분마다 10 초 예).

5. 애플 리케이션

1. 상처 치유
   1. 실험 하루 전에, 우물에 가스 거품 형성을 억제 줄이기 위해 혈청이없는 배지에서 소독을 PDMS 삽입을 만끽해보세요.
   2. 6 잘 판에 confluency 100 % 문화 세포.
   3. 상처를 시뮬레이트하기 위해 p200 피펫 팁과 monolayers에 바로 스크래치를 만듭니다.
   4. 셀 미디어를 대기음, 5 ML 매체와 린스, 다시 대기음. 세포의 monolayer 방해하지 않는 것이 중요합니다.
   5. 리필 세포 증식을 감소 4 ML 혈청 무료 매체로 우물.
   6. 장소는 우물에 삽입하고 해당 산소 농도 각 잘 연결합니다.
   7. 37 온수 무대에서 삽입과 장소 6 - 잘 플레이트 ° C.
   8. 원하는 간격과 전체 기간에 세포의 시간 경과 이미지를 캡처합니다. MATLAB의 T_Scratch, 상처 측정 알고리즘은, unhealed 면적을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

6. 대표 결과

1. 장치 확인
   hypoxic 삽입 장치는 0.5 % 산소로 안정화 2 분 미만을 필요로하는 산소의 평균 시간과 범위의 측면에서 hypoxic 챔버를 통해 큰 향상을 전시하고 있습니다. 장치 막 - 잘 하단 갑 크기가 큰 간격 크기가 정상 상태 산소 농도 값에 도달하는 더 많은 시간을 필요로, 평균 효율을 결정하는 중요한 요인이되었다. 이 디바이스는 또한 여러 조건의 형성을있게 한 우물에 공간 산소 제어할의 큰 거래를 허용하고, 심지어 잘의 표면에 걸쳐 순환 산소 프로필을 생성.
2. 상처 치유
   세포 monolayers을 10 % 또는 21% 산소와 상처의 표면 영역에 노출된 것은 시간이 지남에 따라 분석했다. 21 % 산소에 노출 긁힌 자국이 가장 느린와 10 %의 가장 빠른를 마감했다. 그림 1은 17 시간의 과정을 통해 처음의 이미지를 보여줍니다. 그림 5의 그래프는 실험 기간 동안 두 산소 농도에 대한 개방 상처 영역의 비율을 보여줍니다.

그림 1. 도식 및 장치 기능을 설명하는 다이어그램. 산소 삽입 장치는 종래의 석판술 (microfluidic 네트워크), 복제 성형 (microfluidic 네트워크 및 삽입 비계)에 의해 조작되며, (가스 투과 막) PDMS의 회전 정의. A) 산소 장치는 6 자 판으로 중첩. B) 24 96 - 웰 기둥 배열의 예. 기둥 C) 횡단면 설계도. 산소 입구를 통해 장치에 흐름과 기둥의 하단에 microfluidic 네트워크를 통해 여행. 산소 자유롭게 기둥 하단의 가스 투과 PDMS 막에 걸쳐 확산과 문화 미디어로 녹아 있습니다. D) 평균 연구에 대한 보세 유리 게시물, 위에서 단일 채널 기둥의 다양한 기능을 보여주는 현미경 이미지.

그림 2. 산소 센서와 장치의 확인. 각 웰 내에서 산소 장력은 평면 루테늄 산소 센서를 사용하여 묘사했다. 모든 산소 혼합 미디어 버퍼링에 대한 균형 질소와 5% CO _2가 포함되어 있습니다. A) 플롯의 평균 시간과 효과에 게시 높이의 효과를 설명하고, 멤브레인와 세포 사이를 따라서 산소 확산 거리. 높이가 장치의 하단에 바운드 컷 유리 게시물에 의해 설립되었다. 세 게시 크기의 항복 평균 시간이 많은 hypoxic 챔버를 통해 향상되었습니다. 시간은 로그 스케일입니다. B) 플롯은 0.2 mm 간격 장치의 급속한 산소 평균 응답 시간을 묘사. C) 다중 위치 linescans 또한 장치가 도입된 산소 농도의 균질성을 보장하기 위해 microchannel에서 잘 걸쳐 촬영했다. 그래프가 0 %, 10 %, 10 분 21 % 산소를 일으키는 후 측정 산소 농도를 묘사. D) 장치가 효과적으로 오일을 통해 10 %의 산소를 유지합니다.

그림 3. 더 복잡한 산소 microchannel 디자인 실험. A) 듀얼 조건 microchannel 설정은 안정 0% 14 일 동안 21 % 산소 프로필을 산출. B) 500 μm의 폭 microchannels의 interdigitated과 구불 구 불한 패턴 일에 걸쳐 확장주기적 산소 프로필에 전자 기둥 결과. microchannel 정렬이 어려웠다로 데이터가 한 대표 재판을 묘사합니다.

그림 4. 상처 폐쇄 0, 7, 초기 스크래치 후 17시간의 Timelapse 이미지. 세포 실험 기간 내내 21 % 산소를 전달했다.

그림 5. 스크래치 분석의 상처 치유 속도에 산소 농도의 영향.

Discussion

장치는 표준 SU - 8 석판술, 복제 성형 및 방적 및 polydimethylsiloxane의 완전히 만들어진 정의에 의해 조작됩니다. 가스는 원하는 평형 산소 농도으로 시스템을 구동, microchannel 기둥과 문화 미디어 사이의 농도 구배를 구축하기 위해 장치에 도입입니다. 장치가 효과적으로 잘 내부의 시간적 및 공간적 산소를 조절뿐 아니라 적절한 세포 행동을 조절하기 위해 표시되었습니다. 산소의 공간적 patterning는 기둥의 기지에서 microchannel에 의해 정의되고, 디자인의 다양한 photomask를 만들어 구현 될 수 있도록. 또한, 잘의 가스​​ 단계로 원하는 가스의 주입은 평균 시간과 hypoxia의 정도 향상을 위해 예정입니다. microfluidic 혼합 네트워크는 단 몇 재고 가스 탱크에서 소설 가스 혼합물을 생산하는 수단을 제공하는 장치에 맞게 수 있습니다. 마지막으로, 매체 교환을위한 메커니즘은 세포가 반응 수있는의 multiwell 판에서 장치의 제거에 대한 필요성을 제거합니다.

이 장치는 체외 또는 산소 농도 제어를 필요로 전직의 생체내 실험에서 애플 리케이션을했다. 산소는 신호 경로의 대부분에 영향을 미치는 중요한 생리적 변수로서 이익이 될 연구 분야는 연구자의 창의에 의해 제한됩니다. 산소 농도의 향상된 시간적 컨트롤에서 이익을 얻을 수 일부 필드는 많은 사람 중에서 암 전이, 수면 가사, 그리고 심장의 국소 빈혈 reperfusion 상해를 포함합니다. 예를 들어, 간헐 hypoxia은 지속 hypoxia과 normoxia에 비해 metastastis - 관련된 유전자의 숫자를 upregulating 더 침략 암과 상관되었습니다. 공간 제어 산소 그라디언트가 개발, 간 띠 모양 구성, 약물 독성, 그리고 줄기 세포 틈새에 중요한로서 또한 중요합니다. 이 문서에서 제시 장치가 작은 실험실 발자국, 비교적 간단 운영 요구 사항과 세포에 산소 노출을 통해 훨씬 더 제어할 수있는 시스템을 제공함으로써 연구의 영역의 번호를 도움이 될 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
Planar FOXY sensor	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
Gas	Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150	MicroChem Corp.
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine	SAFC Global	M3803
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513