Summary
ड्रोसोफिला hemocytes विकासशील भ्रूण की सम्पूर्णता पर फैलाने. इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे माउंट करने के लिए और छवि इन fluorescently लेबल hemocytes के साथ भ्रूण का उपयोग प्रवास.
Abstract
कई अध्ययनों से पता सेल का उपयोग प्रवास
Protocol
तैयार
- उपयुक्त ड्रोसोफिला एक hemocyte विशेष Gal4 (जैसे 2 SRP-Gal4) ड्राइवर और एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग यूएएस नियंत्रण (जैसे UAS GFP) के तहत फ्लोरोसेंट संवाददाता युक्त लाइनों प्राप्त करते हैं . एसआरपी Gal4, UAS 3 - GMA या crq Gal4 UAS - GFP, 4, 5 के लिए homozygous मक्खियों इमेजिंग प्रयोजनों के लिए विशेष रूप से (नायब GMA moesin के actin बाध्यकारी डोमेन के लिए इनकार GFP) उपयोगी होते हैं, के एक चर्चा के लिए नीचे देखें Gal4 ड्राइवरों और UAS की रेंज उपलब्ध constructs (ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र एक विस्तृत विविधता शामिल हैं).
- आमतौर पर आनुवंशिक पार बाहर किया जाता है कि ऐसे उत्परिवर्ती alleles फ्लोरोसेंट balancers CTG या TTG 6 का उपयोग Gal4 ड्राइवरों और constructs UAS वैकल्पिक मुताबिक़ क्रोमोसोम पर किया जाता है के साथ संतुलित कर रहे हैं ,. यह CTG / TTG जुड़े GFP प्रतिदीप्ति (यह 2.11 स्तर पर किया जाता है) के अभाव के आधार पर homozygous म्यूटेंट का चयन करने के लिए यह संभव बनाता है.
- एक सेब का रस अगर 7 थाली के साथ एक पिंजरे बिछाने में शेयरों और जगह मक्खियों बढ़ाना . मक्खियों कम से कम दो दिनों की जरूरत है बिछाने पिंजरे acclimatize पहले पर्याप्त भ्रूण रखी जा शुरू. सामान्य में प्रत्येक सेक्स के बीस मक्खियों के लिए इमेजिंग के लिए पर्याप्त भ्रूण उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हो सकता है लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अलग अलग लाइनों प्रजनन की डिग्री भिन्न है चाहिए. हम 55mm पेट्री डिश है कि एक प्लास्टिक बीकर के नीचे में फिट हैं, उसके आधार पर पंचर के लिए airflow की अनुमति का उपयोग करें. भ्रूण संग्रह के सटीक साधन महत्वहीन है, लेकिन समय महत्वपूर्ण है क्रम में सही ढंग से इकट्ठा भ्रूण का मंचन किया.
- एक रात में सेब का रस अगर 25 डिग्री सेल्सियस पर या एक समय की थाली से बनाए रखा थाली से भ्रूण लीजिए. बाद के लिए हम आम तौर पर मक्खियों एक पूर्व गर्म थाली पर 4 घंटे के लिए रखना करने के लिए प्लेट को हटाने और यह 18 ° C पर 15-16 घंटे के लिए भ्रूण के बढ़ते से पहले रखने के पहले, अनुमति देते हैं, इस के माध्यम से देर चरण 12 से भ्रूण प्रदान करता है के लिए 15 विकास के चरण. एक रातोंरात थाली चरणों की एक बड़ी विविधता शामिल है लेकिन hemocytes में फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति के उच्च स्तर 25 में एक समय की लंबी अवधि के कारण का लाभ प्रदान करता है सी Gal4 - यूएएस प्रणाली के रूप में तापमान संवेदनशील है °.
प्रक्रिया
- सेब का रस अगर पानी की एक छोटी राशि और एक नरम इत्तला दे दी तूलिका का उपयोग की थाली से भ्रूण हटाना. उखाड़ फेंकना भ्रूण नग्न आंखों के साथ आसानी से देखा जा सकता है.
- एक सेल (फिशर) झरनी या घर बना एक बीकर पर बेकार पानी लेने के लिए आयोजित की टोकरी में सेब का रस अगर थाली से पानी गिरने से 7 की टोकरी. भ्रूण स्थानांतरण
- 2.2 कदम दोहराएँ जब तक आप संतुष्ट हैं आप पर्याप्त सेब का रस अगर थाली से हस्तांतरित भ्रूण है.
- सेल झरनी / पानी का उपयोग टोकरी में भ्रूण धो लें.
- प्लेस सेल झरनी / सेब का रस अगर थाली के पेट्री डिश ढक्कन में टोकरी और पर्याप्त स्वच्छ सेल झरनी / टोकरी में भ्रूण निलंबित ब्लीच जोड़ने.
- Brightfield के तहत एक विच्छेदन खुर्दबीन पर भ्रूण की dechorionation का पालन करें: dechorionation पूरा जब पृष्ठीय appendages के भंग कर दिया है, जो दो मिनट के भीतर हो जाना चाहिए.
- ब्लीच / झरनी टोकरी सेल युक्त भ्रूण से निकालें और बंद अवशिष्ट पानी का उपयोग ब्लीच धोने. ब्लीच के सभी निशान से 2.8 कदम आगे बढ़ने से पहले हटा दिया जाना चाहिए. अगर वहाँ अवशिष्ट ब्लीच नीले रंग / सफेद गुलाबी प्रक्षालित हो जाएगा है - एक का आकलन है कि सभी ब्लीच हटा दिया गया है चाल के लिए रवाना नीले रंग प्रयोगशाला ऊतकों पर अवशिष्ट पानी दाग है.
- शेष प्रयोगशाला ऊतक / mediwipes सेल / झरनी टोकरी के नीचे करने के लिए लागू का उपयोग कर पानी ब्लाट.
- एक पेट्री डिश ढक्कन में पानी की एक छोटी बूंद रखें. ठीक एक तूलिका के साथ, भ्रूण टोकरी से सभी dechorionated भ्रूण को इकट्ठा करने और उन्हें छोटी बूंद में resuspend. अगले एक micropipette का उपयोग पानी aspirating या ध्यान से यह एक प्रयोगशाला ऊतक / mediwipes के साथ अवशोषित द्वारा भ्रूण सूखी.
- एक बार भ्रूण सूख गया है, voltalef तेल की एक बूंद के लिए सभी भ्रूण कवर जोड़ें. तेल की एक दूसरी छोटी सी बूंद भ्रूण युक्त छोटी बूंद के निकट रखो. नो बॉल हम voltalef तेल की एक ब्रिटेन आधारित आपूर्तिकर्ता खोजने में असमर्थ किया गया है, हेलोकार्बन 700 तेल (सिग्मा) के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
- वांछित जीनोटाइप तेल छोटी बूंद से watchmakers संदंश (संख्या 5) की एक जोड़ी का उपयोग कर के एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत उचित भ्रूण मंचन का चयन करें. इन संदंश तुला भीतर (चित्रा 1) के क्रम में उनके vitelline झिल्ली puncturing के बिना भ्रूण स्कूप चाहिए. दूसरा तेल छोटी बूंद के लिए चयनित भ्रूण स्थानांतरण. यह महत्वपूर्ण है कि आप विदारक माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोसेंट hemocytes देखने के क्रम में confocal खुर्दबीन (चित्रा 2) पर अच्छा छवियों को एकत्र करने में सक्षम होना करने में सक्षम हैं. हम आम तौर पर छवि वेंट्रल midline या मंच 15 भ्रूण पर hemocytes की पार्श्व प्रवास करने के लिए मंच 13/14 भ्रूण माउंटभ्रूण से अधिक प्रसार निम्नलिखित hemocytes की गतिशीलता छवि के लिए.
- एक डिश / Petriperm Lumox (Sarstedt) के नीचे दो (18x18mm, मोटाई 1) coverslips voltalef तेल के 2 छोटे बूंदों का उपयोग कर उन्हें (चित्रा 3) के बीच लगभग 1cm जा चिपके रहते हैं, इन पर रखा coverslip समर्थन किया जाएगा भ्रूण, इसलिए के रूप में उन्हें कुचलने के लिए नहीं. Petriperm व्यंजन (50mm व्यास) एक hydrophobic, गैस पारगम्य झिल्ली होते हैं. हम पाते हैं कि व्यंजन का उपयोग करने के लिए एक बार वे कई बार इस्तेमाल किया गया है (व्यंजन 70% इथेनॉल के साथ सफाया हो सकता है है और reused) आसान हो.
- विच्छेदन खुर्दबीन पर brightfield के तहत लेने चयनित भ्रूण तुला संदंश और उन्हें उदर पक्ष लाइन अप के साथ एक के बाद एक और समानांतर coverslips के किनारे (चित्रा 3). 15 भ्रूणों के लिए इस रास्ते में अपनी निपुणता और आपके धैर्य के आधार पर संरेखित, यह संभव है. यह महत्वपूर्ण है भ्रूण धीरे हेरफेर के रूप में दोनों भ्रूण और Petriperm पकवान झिल्ली नाजुक रहे हैं और आसानी से उठी किया जा सकता है है.
- एक बार भ्रूण गठबंधन कर रहे हैं तेल की एक छोटी सी बूंद को जोड़ने और इसे करने के लिए दो coverslips के बीच एक समरूप परत के रूप में फैल. बाद तेल फैल गया है (यह एक कुछ मिनट लग सकते हैं) जाँच करें कि भ्रूण अभी भी ventral पक्ष हैं. यदि भ्रूण थोड़ा लुढ़का हुआ है, उन्हें फिर से reposition संदंश के साथ.
- अंत में, (3 संख्या) चिमटी जगह भ्रूण (18x18mm, मोटाई 1) पर एक coverslip, दो पहले से पालन coverslips पर आराम का उपयोग कर. गोंद coverslip इस coverslip नेल पॉलिश (चित्रा 3) का उपयोग का समर्थन करता है.
- Confocal या व्यापक क्षेत्र खुर्दबीन के लिए घुड़सवार भ्रूण के साथ Petriperm पकवान ले लो और एक उपयुक्त अनुकूलक का उपयोग कर मंच पर Petriperm पकवान माउंट. या तो एक ईमानदार या उलटा माइक्रोस्कोप उद्देश्य coverslip (के रूप में झिल्ली के माध्यम से करने का विरोध किया) के माध्यम से ध्यान केंद्रित लेंस के साथ किया जा सकता है.
प्रतिनिधि नतीजे:
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे ड्रोसोफिला भ्रूण भ्रूण के ventral पक्ष पर hemocytes के रहते इमेजिंग के लिए माउंट करने के लिए. यदि सही ढंग से किया यह आसान हो hemocytes के चित्र या फिल्में या तो उत्पन्न होगा. प्रमुख निर्धारक hemocytes (विशेष उद्देश्य लेंस में) की छवि के लिए इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी है, लेकिन अधिग्रहीत छवियों की प्रकृति भी विकास के चरण पर निर्भर करेगा, तापमान भ्रूण में उठाए गए थे और Gal4 और UAS लाइनों का इस्तेमाल किया.
फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर hemocytes अधिक आसानी के साथ imaged करने के लिए सक्षम होगा, इसलिए यह महत्वपूर्ण है hemocytes देखने के लिए सक्षम हो सकता है जब भ्रूण प्रोटोकॉल (चित्रा 2 स्पष्ट hemocytes के भ्रूण के भीतर उदाहरण, एक साथ लिया होता के 2.11 चरण में हैं कैमरा एक विच्छेदन खुर्दबीन के लिए फिट). Gal4 और UAS constructs इसलिए बढ़ संख्या एक बड़ा संकेत से शोर अनुपात सक्षम. इसके अलावा इस उच्च लेजर की तीव्रता या बढ़ा जोखिम बार के लिए की जरूरत है जब इमेजिंग, जो बारी में hemocyte व्यवहार के लिए सक्षम बनाता है समय की लंबी अवधि के लिए पीछा करने के लिए कम कर देता है.
GFP अभिव्यक्ति की बहुत उच्च स्तर hemocyte आकारिकी के ठीक विवरण दिखाने के लिए, विशेष रूप से पतली शीट की तरह lamellae कि परिपत्र सेल शरीर (चित्रा -4 ए बी) के चारों ओर. परिपत्र क्षेत्रों को छोड़कर GFP phagosomes (4A - सी चित्रा) का प्रतिनिधित्व करते हैं. Filopodia तरह फिंगर भी lamellae (4B चित्रा) से उभरते देखा जा सकता है है. दो Gal4 ड्राइवरों के लिए इन प्रक्रियाओं (चित्रा 4C), खासकर अगर एक या एक से अधिक एसआरपी Gal4 है (चर्चा देखें) के लिए पर्याप्त रहते हैं, लेकिन धीमी confocal खुर्दबीन स्कैनिंग गति पर या अधिक से अधिक लेसर शक्ति की आवश्यकता हो सकता है. के रूप में अभिव्यक्ति के स्तर में कमी इसे और अधिक मुश्किल हो जाता है hemocytes की protrusions छवि, फिर भी यह अभी भी संभव है इन शर्तों के तहत hemocytes के प्रवास को ट्रैक सेल शरीर के रूप में स्पष्ट रहता है जब भी protrusions कम स्पष्ट (चित्रा 4D) हैं.
विकास के पहले चरण (अप करने के लिए 13 चरण) कम hemocytes एक दूसरे से निकट संपर्क में विस्थापित और यह अक्सर व्यक्ति की कोशिकाओं भेद करना मुश्किल है. मंच के अंत तक 13 hemocytes वेंट्रल midline (चित्रा 5A) के नीचे एक एकल लाइन का गठन किया है, तो चलता - फिरता बनने वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (चित्रा 5B) के किनारों को laterally विस्थापित. hemocytes की गतिशील protrusions के भीतर actin cytoskeleton सीधे GMA (चित्रा 5C) या चेरी moesin की अभिव्यक्ति के माध्यम से देखा जा सकता है है.
इस रास्ते में भ्रूण बढ़ते गैस आदान - प्रदान की अनुमति देता है और निर्जलीकरण रोकता है और भ्रूण व्यवहार्य निम्नलिखित इमेजिंग रहते हैं. यदि भ्रूण बढ़ते यह आम तौर पर स्पष्ट है के रूप में भ्रूण सामग्री अपनी vitelline झिल्ली के माध्यम से लीक करेंगे दौरान क्षतिग्रस्त है. यदि एक भ्रूण तो निर्जलीकरण शुरू करता है इस बार vitelline झिल्ली में विकृतियों के द्वारा देखा जा सकता है किया गया है. कभी कभी एक भ्रूण एक timelapse फिल्म के दौरान रोल करेंगे, लेकिन यह केवल करने के लिए अब timescale फिल्मों के लिए समस्याग्रस्त हो जाता है. Lastly, एक ही बार में कई भ्रूण बढ़ते experimentalist उनके प्रयोग के लिए एकदम सही ओरिएंटेशन में एक भ्रूण प्राप्त करने का सबसे अच्छा मौका देता है.
चित्रा 1. Dechorionated भ्रूण के हेरफेर के लिए संदंश.
watchmakers संदंश (आकार नंबर 5) के सुझावों तुला भीतर फैशन के उपकरण भ्रूण स्कूप के रूप में यहाँ दिखाया क्रम में करना चाहिए. तुला क्षेत्र के बाहरी सतह भी उपयोगी है जब Petriperm झिल्ली पर स्थिति के लिए भ्रूण हेरफेर के रूप में वे कोई तेज किनारों है कि भ्रूण पंचर सकता है के अधिकारी.
चित्रा 2. भ्रूण है कि अच्छे रहते इमेजिंग परिणाम निकलेगा की छवियों प्रतिनिधि .
Voltalef तेल में dechorionated भ्रूण (प्रोटोकॉल 2.11 स्तर पर) की छवियाँ एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन विदारक पर लिया. Crq Gal4, भ्रूण UAS GFP, चरण 13 (ए) और 15 (बी) चरण एसआरपी Gal4, UAS - GFP के पार्श्व दृश्य. एक 15 चरण एसआरपी Gal4, UAS - GFP / पार्श्व दृश्य, crq Gal4, uas-GFP/uas-N17Rac भ्रूण (सी) में जो hemocytes सिर से बाहर पलायन करने में विफल रहा है, प्रदर्शन भ्रूण क्या जब hemocytes की तरह देखो उनके प्रवासी मार्गों के साथ स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. Crq Gal4, UAS GFP पेट के जटिल संरचना विकास (डी) के इस स्तर पर दिखा भ्रूण, एक 17 चरण एसआरपी Gal4, UAS - GFP के पार्श्व दृश्य मांसपेशी संकुचन की शुरुआत इस से परे भ्रूण के रहते इमेजिंग रोकता है विकास की अवस्था. चरण 13 (ई) और 14 चरण के ventral दृश्य (एफ) एसआरपी Gal4, UAS लाल डंक भ्रूण fluorescently लेबल नाभिक के साथ hemocytes का प्रसार दिखा . प्रतिदीप्ति द्वारा प्रोटोकॉल के 2.11 चरण में hemocytes अवलोकन करने के लिए एक उत्कृष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए एक शर्त है, पूर्वकाल सभी छवियों के लिए सही है.
चित्रा 3. एक डिश / Petriperm Lumox पर भ्रूण के बढ़ते.
दो 18x18mm coverslips (1 मोटाई) Petriperm तेल की एक छोटी सी बूंद, के बारे में के रूप में दिखाया गया 1cm द्वारा अलग का उपयोग पकवान के नीचे सामना करने के लिए फंस रहे हैं. भ्रूण तो उदर पक्ष लाइन में खड़ा कर रहे हैं उनके लंबे (पूर्वकाल पोस्टीरियर) अक्ष coverslips के किनारों के समांतर के साथ और तेल की एक छोटी बूंद के साथ कवर किया. एक बार तेल के लिए एक तिहाई coverslip (18x18mm 1 मोटाई) धीरे तेल कवर कुचल होने से भ्रूण को रोकने के लिए पुल के रूप में दो पहले पालन coverslips का उपयोग भ्रूण के शीर्ष पर रखा गया है के बीच की खाई को दो coverslips भरने के लिए फैल गया है. यह coverslip तो दो coverslip पुलों का उपयोग नेल पॉलिश के दो छोटे बूंदों के लिए सरेस से जोड़ा हुआ है. एक बार सेट, भ्रूण उद्देश्य coverslip (के रूप में Petriperm झिल्ली के माध्यम से करने का विरोध किया) के माध्यम से नीचे ध्यान केंद्रित लेंस के साथ एक ईमानदार या उलटा माइक्रोस्कोप पर imaged किया जा सकता है.
चित्रा 4. GFP लेबल hemocytes के रहते इमेजिंग से प्रतिनिधि परिणाम है.
Z-अनुमानों crq Gal4, भ्रूण UAS - GFP (एबी), एक 14 चरण एसआरपी Gal4, UAS - GFP के ventral पक्ष पर hemocytes की. (ए) एक कम बढ़ाई ऐसे रूप में timelapse फिल्मों में hemocyte विकास प्रवास पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया छवि है. (बी) उदर midline पर hemocytes की एक उच्च अभी भी बढ़ाई है, उनके आकारिकी के ठीक विवरण दिखा. (सी) एक एकल 1 hemocytes की एक 14 चरण एसआरपी Gal4, UAS - GFP / वेंट्रल midline पर मीटर का टुकड़ा है, crq - Gal4, UAS GFP + / भ्रूण, खुलासा है कि कम Gal4 ड्राइवरों और UAS की प्रतिलिपि संख्या constructs भी कर रहे हैं अच्छा छवियों को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है. (डी) 14 चरण crq Gal4, भ्रूण UAS GFP में hemocytes की z प्रक्षेपण प्रदर्शित करता है. यहाँ hemocyte protrusions GFP की कम अभिव्यक्ति के कारण कम स्पष्ट हैं, लेकिन यह अभी भी संभव है कि फिल्में बनाने के लिए और Gal4 ड्राइवर और UAS के इस संयोजन का निर्माण के साथ hemocyte प्रवास ट्रैक. छवियाँ एक Leica LSM510 confocal खुर्दबीन पर ले जाया गया, पूर्वकाल सभी छवियों में है, छवियों की परिधि में छल्ले vitelline झिल्ली autofluorescence की वजह से कर रहे हैं.
चित्रा 5. GMA व्यक्त hemocytes के रहते इमेजिंग से प्रतिनिधि परिणाम है.
Z-13 चरण के उदर midline (ए) और 14 मंच पर hemocytes के अनुमानों (बी) एसआरपी Gal4, UAS GMA भ्रूण timelapse फिल्में से लिया hemocytes के विकास प्रवास दिखाने. Actin गतिशीलता पर विस्तृत जानकारी GMA व्यक्त hemocytes (सी) के उच्च बढ़ाई इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. GMA GFP के होते हैं moesin और लेबल actin filaments actin बाध्यकारी डोमेन के लिए जुड़े हुए हैं. पूर्वकाल सभी छवियों में है, छवियों को एक confocal खुर्दबीन पर ले जाया गया.
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Discussion
इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण तत्वों को स्पष्ट रूप से लेबल hemocytes के साथ स्वस्थ भ्रूण के चयन कर रहे हैं और उन्हें नुकसान पहुँचाए बिना उन्हें ध्यान से माउंट. एक बार भ्रूण हेलोकार्बन तेल में हैं वे निर्जलीकरण के लिए प्रतिरोधी रहे हैं और एक बार घुड़सवार कई घंटे के लिए imaged किया जा सकता है. हमारे हाथ में हम तीन घंटे के लिए छवि hemocytes, भ्रूण या स्पष्ट तस्वीर क्षति का नगण्य निर्जलीकरण के साथ कर सकते हैं, हमारे Zeiss LSM510 confocal खुर्दबीन पर हर तीन मिनट में एक 40x उद्देश्य के साथ छवियों के z ढेर लेने. चूंकि hemocytes अत्यधिक गतिशील हैं वहाँ एक स्थानिक और लौकिक संकल्प के बीच व्यापार बंद हो सकता है: यदि एक बहुत उच्च संकल्प छवि hemocyte और यह के भीतर संरचनाओं की जरूरत है स्कैन के दौरान स्थानांतरित कर सकते हैं. कैसे छवियों बाद एकत्र कर रहे हैं की सटीक जानकारी प्रयोगात्मक को संबोधित किया प्रश्नों के द्वारा निर्धारित किया जाएगा.
हम आम तौर पर लेबल hemocytes UAS GFP या UAS-GMA 3 का उपयोग करें; UAS GMA विशेष रूप से उपयोगी है के बाद से, अंकन hemocytes अलावा, यह actin रेशा गतिशीलता का एक पढ़ने के बाहर प्रदान करता है. अन्य UAS constructs hemocyte व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: उदाहरण के लिए UAS - चेरी 9 constructs वैकल्पिक fluorophores या 10 UAS - ताऊ - GFP एक hemocyte भीतर सूक्ष्मनलिकाएं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में शोषण किया जा सकता है. UAS constructs एक परमाणु लेबल के साथ विशेष रूप से hemocyte आंदोलनों की स्वचालित ट्रैकिंग (चित्रा 2 ई - एफ) के लिए मूल्यवान हो सकता है है. दो रंग इमेजिंग भी संभव है (उदाहरण के दोनों actin और microtubule cytoskeletons UAS चेरी moesin और UAS ताऊ - GFP का उपयोग लेबल, क्रमशः कर सकते हैं, एक hemocyte विशेष Gal4 ड्राइवर के नियंत्रण के अधीन) . जैसा कि पहले उल्लेख किया है, hemocytes के रहते इमेजिंग में एक प्रमुख निर्धारक Gal4 कार्यरत ड्राइवर है: वर्तमान hemocyte विशिष्ट प्रमोटरों के लिए संबंध SRP-Gal4 2> crq Gal4> 4 pxn - Gal4 11, के रूप में केवल SRP-Gal4 लेबल hemocytes के लिए पर्याप्त के साथ विषमयुग्मजी जब, जबकि crq Gal4 या pxn - Gal4 के कम से कम दो प्रतियां hemocytes रहते निरीक्षण की जरूरत है. एसआरपी - Gal4 साथ बहरहाल इष्टतम इमेजिंग homozygosity (या एक वैकल्पिक Gal4 चालक की उपस्थिति) की आवश्यकता है.
निम्नलिखित hemocytes इस रास्ते में रहते हैं यह 8 सिर से उनके विकास प्रसार अध्ययन के लिए और पालन कैसे वे cues के साथ बातचीत संभव है कि पैटर्न इस प्रक्रिया, जमा मैट्रिक्स और निगल apoptotic लाशों. Hemocytes भी एक दिलचस्प प्रणाली के साथ जो सेल प्रवास की मशीनरी की जांच करने के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं, कि actin या microtubule cytoskeletons के घटकों की कमी भ्रूण में hemocytes के प्रवास की जांच करके यह संभव है vivo समारोह में अपने और अधिक स्पष्ट रूप से समझने (जैसे रो GTPases 4, 12). UAS के शोषण के लिए लेबल इन cytoskeletons अभी तक उनके विनियमन पर और अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करता है constructs.
हम इस तकनीक को संशोधित किया है लेजर प्रेरित wounds4 और fluorescently लेबल 13 बैक्टीरिया के इंजेक्शन के लिए अपनी प्रतिक्रिया के रूप में संदर्भों की एक किस्म में hemocyte व्यवहार की जांच. इसके अलावा इस विधि को आसानी से अलग Gal4 ड्राइवरों को चुनने के द्वारा छवि अन्य प्रकार सेल के लिए कर सकते हैं अनुकूलित किया जा. उदाहरण के लिए हम पहले पृष्ठीय उपकला Gal4 14 ड्राइवरों, 15 का उपयोग बंद करने imaged है . इस तकनीक के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए आवेदन Gal4 ड्राइवर, भ्रूण और खुर्दबीन इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता के प्रकार के भीतर imaged किया जा कोशिकाओं की स्थिति की शक्ति द्वारा सीमित है, multiphoton confocal सूक्ष्मदर्शी छवि सेल गहरी व्यवहार करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम भ्रूण के भीतर (जैसे रोगाणु सेल transepithelial प्रवास 16), जबकि पारंपरिक confocal सूक्ष्मदर्शी इन गहराई तक पहुँचने में असमर्थ हैं (यह कारण है कि हम ventral midline जहां hemocytes बहुत सतही हैं, विकासशील वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड और epidermis के बीच फंस के साथ छवि).
इस प्रोटोकॉल की ताकत है कि यह रहते इमेजिंग के लिए एक स्वस्थ हालत में भ्रूण को बनाए रखने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है. जबकि मैनुअल निपुणता की एक डिग्री करने के लिए भ्रूण स्थिति के लिए आवश्यक है, यह मास्टर करने के लिए एक आसान तकनीक है और जल्दी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देता है और आसानी से संशोधित किया जा सकता है अलग Gal4 ड्राइवरों और UAS constructs का उपयोग करने के लिए hemocyte जीव विज्ञान के कई विभिन्न पहलुओं की जांच. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल hemocytes सीमित नहीं वैकल्पिक Gal4 ड्राइवरों के उपयोग के बाद से अन्य ऊतक प्रकार के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है.
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Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल के भीतर और पॉल मार्टिन और एंटोनियो Jacinto की प्रयोगशालाओं के साथ सहयोग में हमारे काम के माध्यम से विकसित किया गया है. हम अपनी उत्कृष्ट सेवा के लिए और शेयर के लिए उड़ान भरने लाइनों जारी रखने के लिए ड्रोसोफिला समुदाय ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र धन्यवाद. बी एस वर्तमान में एक बीबीएसआरसी परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. WW वेलकम ट्रस्ट कैरियर विकास फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70μm pores |
| Halcarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt Ltd | 96077305 |
References
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