Summary
Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.
Abstract
Muitos estudos de migração de células endereço usando
Protocol
Preparação
- Obter linhas apropriadas Drosophila contendo um hemócitos específicos Gal4 driver (por exemplo, srp-Gal4 2) e um repórter geneticamente codificado fluorescente sob controle UAS (por exemplo, uas-GFP). Moscas homozigotos para srp-Gal4, uas-GMA 3 ou CRQ-Gal4, uas-GFP 4, 5 são particularmente úteis para fins de imagem (nb GMA é GFP fundida ao domínio de ligação de actina de moesin), veja abaixo para uma discussão sobre a gama de Gal4 motoristas e uas construções disponíveis (o Centro de Bloomington stock contém uma grande variedade).
- Cruzes tipicamente genética são realizadas de tal forma que alelos mutantes são equilibradas usando fluorescentes balanceadores CTG ou TTG 6, com Gal4 motoristas e uas construções realizadas em alternativa cromossomos homólogos. Isto torna possível selecionar mutantes homozigotos com base na ausência de CTG / TTG-associado de fluorescência da GFP (isto é feito na fase 2.11).
- Ampliar ações e moscas lugar em uma gaiola de assentamento com uma placa de ágar suco de maçã 7. As moscas precisa de pelo menos dois dias para aclimatar à gaiola que estabelece o suficiente antes de embriões começam a ser estabelecidas. Em geral twenty moscas de cada sexo deve ser suficiente para gerar embriões suficiente para geração de imagens, mas deve ser notado que linhas diferentes têm diferentes graus de fertilidade. Nós usamos 55 milímetros pratos de Petri que se encaixam na parte inferior de um copo de plástico, perfurado na sua base para permitir o fluxo de ar. A forma exata da colheita de embriões não é importante, mas os horários são críticos, a fim de coletar corretamente encenado embriões.
- Coletar embriões de um dia para o outro placa de ágar suco de maçã mantida a 25 ° C ou a partir de uma placa cronometrados. Para este último que geralmente permitem que as moscas para colocar em um prato pré-aquecido por 4 horas, antes de remover a placa e colocá-lo a 18 ° C por 15-16 horas antes da montagem de embriões, o que fornece embriões de fase tardia de 12 a para o estágio 15 de desenvolvimento. Uma placa de overnight contém uma maior diversidade de fases, mas oferece a vantagem de níveis mais elevados de expressão repórter fluorescentes em hemócitos devido a um longo período de tempo a 25 ° C como o sistema Gal4-UAS é sensível à temperatura.
Procedimento
- Desalojar embriões a partir da placa de ágar suco de maçã utilizando uma pequena quantidade de água e um pincel macio de ponta. Embriões desalojado pode ser visto facilmente a olho nu.
- Transferência de embriões para um filtro de células (Fisher), ou home-made cesta de 7 por despejar água a partir da placa de ágar suco de maçã na cesta realizada ao longo de um copo para pegar água de resíduos.
- Repita o passo 2,2 até ficar satisfeito você tem embriões suficientes transferidos da placa de ágar suco de maçã.
- Lavar embriões em coador de células / cesta com água.
- Célula local do filtro / cesta na tampa placa de Petri da placa de ágar suco de maçã e acrescente o suficiente lixívia pura para suspender embriões no coador de células / cesta.
- Siga dechorionation dos embriões em um microscópio de dissecção sob brightfield: dechorionation está completa quando os apêndices dorsal ter dissolvido, o que deve ocorrer dentro de dois minutos.
- Remover células do filtro / cesta contendo embriões a partir da lixívia e lavar lixívia residual com água. Todos os vestígios de água sanitária deve ser removido antes de prosseguir para o passo 2.8. Um truque para avaliar se todos os lixívia foi removido para fora da água residual blot em tecidos de cor azul laboratório - se houver lixívia residual a cor azul vai ser branqueada branco / rosa.
- Blot fora da água restante através de tecidos de laboratório / mediwipes aplicado na face inferior da célula coador / cesta.
- Coloque uma gota de água em uma tampa de placa de Petri. Com um pincel fino, recolher todos os embriões dechorionated da cesta embrião e ressuspender-los na gota. Em seguida secar os embriões por aspiração de água usando uma micropipeta ou absorvendo-o cuidadosamente com um tecido de laboratório / mediwipes.
- Uma vez que os embriões foram secos, adicione uma gota de óleo voltalef para cobrir todos os embriões. Colocar uma segunda gota pequena de óleo junto ao gotículas contendo os embriões. NB temos sido incapazes de encontrar um fornecedor baseada no Reino Unido de óleo voltalef; halocarbono óleo 700 (Sigma) pode ser utilizado.
- Sob um microscópio fluorescente dissecção selecionar adequadamente encenado embriões do genótipo desejado usando um par de fórceps relojoeiros (número 5) a partir da gota de óleo. Estas pinças devem ser dobrados para dentro (Figura 1), a fim de colher-se os embriões sem a sua perfuração da membrana vitelina. Transferência de embriões selecionados para a segunda gota de óleo. É importante que você é capaz de ver hemócitos fluorescente no microscópio de dissecação, a fim de ser capaz de coletar boas imagens no microscópio confocal (Figura 2). Normalmente, montagem embriões em estágio 13/14 à migração imagem lateral do hemócitos na linha média ventral ou estágio 15 embriõespara a imagem da motilidade dos hemócitos seguintes dispersão sobre o embrião.
- Vara duas lamelas (18x18mm, espessura 1) para a parte inferior de um prato Petriperm / Lumox (Sarstedt), usando duas pequenas gotas de óleo voltalef, deixando cerca de um centímetro entre eles (Figura 3), que serão utilizados para apoiar uma lamela colocada sobre os embriões, de modo a não esmagá-los. Pratos Petriperm (diâmetro 50mm) contêm uma hidrofóbica, a membrana gás-permeáveis. Nós achamos que os pratos se tornam mais fáceis de usar, uma vez que têm sido usadas várias vezes (os pratos podem ser limpas com álcool 70% e reutilizados).
- Sob brightfield no microscópio de dissecção, pegar embriões selecionados, um por um com a pinça dobrados e alinhá-las lado ventral para cima e paralela à borda da lamínulas (Figura 3). É possível alinhar até 15 embriões, desta forma, dependendo da sua destreza e paciência. É importante para manipular os embriões gentilmente tanto como os embriões e da membrana prato Petriperm são frágeis e podem ser facilmente rompido.
- Uma vez que os embriões são alinhados adicionar uma pequena gota de óleo e deixe-a se espalhar para formar uma camada homogênea entre as duas lamelas. Depois que o óleo se espalhou (isso pode levar alguns minutos) verificar que os embriões ainda estão lado ventral para cima. Se os embriões têm rolado ligeiramente, reposicioná-los novamente com a pinça.
- Finalmente, usando uma pinça (número 3) coloque uma lamínula (18x18mm, espessura 1) ao longo dos embriões, descansando sobre as duas lamínulas previamente aderido. Cola esta lamela à lamela suporta o uso de unha polonês (Figura 3).
- Leve o prato Petriperm com embriões montado ao microscópio confocal ou wide-campo e montar o prato Petriperm no palco usando um adaptador apropriado. Ou um microscópio vertical ou invertida pode ser usado, com a lente objetiva com foco através da lamela (ao contrário através da membrana).
Resultado representante:
Este protocolo descreve como montar Drosophila embriões para geração de imagens ao vivo de hemócitos no lado ventral do embrião. Se feito corretamente, será fácil de gerar ou fotos ou filmes de hemócitos. O principal determinante é o microscópio usado para a imagem do hemócitos (em particular a lente objetiva), mas a natureza das imagens adquiridas também vai depender do estágio de desenvolvimento, a temperatura, os embriões foram levantadas na e as linhas Gal4 e uas usado.
Níveis mais elevados de expressão da proteína fluorescente permitirá hemócitos a ser trabalhada com maior facilidade, por isso é importante ser capaz de ver hemócitos quando os embriões estão em fase de 2,11 do protocolo (Figura 2 contém exemplos de hemócitos clara dentro embriões, tiradas com uma câmera equipada com um microscópio de dissecção). Números, portanto, aumento da Gal4 e constrói uas permitir uma maior relação sinal-ruído. Além disso reduz a necessidade de laser de alta intensidade ou tempo de exposição aumentou quando de imagem, que por sua vez permite um comportamento hemócitos a serem seguidos por longos períodos de tempo.
Níveis muito altos de expressão GFP vai aparecer pequenos detalhes da morfologia hemócitos, particularmente as lamelas como folhas finas que circundam o corpo da célula circular (Figura 4A-B). Regiões circulares excluindo GFP representam fagossomos (Figura 4A-C). Dedo-como filopodia também pode ser visto emergindo das lamelas (Figura 4B). Dois motoristas permanecem Gal4 suficiente para ver estes processos (Figura 4C), especialmente se um ou mais é srp-Gal4 (ver discussão), porém menor velocidade de digitalização ou maior poder de laser sobre o microscópio confocal pode ser necessária. Como diminuir os níveis de expressão se torna mais difícil para a imagem do saliências de hemócitos, no entanto, ainda é possível acompanhar a migração dos hemócitos sob essas condições como o corpo da célula continua a ser evidente, mesmo quando as saliências são menos claras (Figura 4D).
Em fases anteriores de desenvolvimento (até estágio 13) hemócitos migram em estreito contacto uns com os outros e muitas vezes é difícil distinguir células individuais. Ao final do estágio 13 hemócitos formaram uma única linha para baixo da linha mediana ventral (Figura 5A), então, cada vez mais móveis, migrar lateralmente para as bordas do cordão nervoso ventral (Figura 5B). O citoesqueleto de actina dentro do saliências dinâmica de hemócitos pode ser observado diretamente através da expressão do GMA (Figura 5C) ou cereja-moesin.
Montagem da embriões desta forma permite trocas gasosas e evita a desidratação e embriões permanecem viáveis imagem seguinte. Se o embrião é danificado durante a montagem é geralmente óbvia como o conteúdo do embrião vai vazar através da sua membrana vitelina. Se um embrião não começar a desidratar, então este pode muitas vezes foi visto por deformações na membrana vitelina. Ocasionalmente, um embrião vai rolar durante o curso de um filme timelapse, no entanto isso só tende a ser problemático para filmes mais longos prazos. Lastly, montando vários embriões ao mesmo tempo dá ao experimentalista a melhor chance de obter um embrião na orientação perfeita para seu experimento.
Figura 1. Pinças para a manipulação de embriões dechorionated.
As pontas dos relojoeiros fórceps (número, tamanho 5) devem ser dobrados para dentro, a fim de moda uma ferramenta para recolher embriões como mostrado aqui. A superfície externa da região dobrado também é útil para manipular embriões ao se posicionar sobre a membrana Petriperm como eles não possuem bordas afiadas que podem perfurar o embrião.
Figura 2. Imagens representativas de embriões que renderá bons resultados de imagem ao vivo.
Imagens de embriões dechorionated em óleo voltalef (2,11 na fase do protocolo), tomada em um microscópio de fluorescência de dissecação. Vistas laterais do estágio 13 (A) e estágio 15 (B) srp-Gal4, uas-GFP; CRQ-Gal4, uas-GFP embriões. Vista lateral de um palco 15 srp-Gal4, uas-GFP / +; CRQ-Gal4, embrião uas-GFP/uas-N17Rac (C) em que hemócitos não conseguiram migrar para fora da cabeça, demonstrando que os embriões olhar como quando hemócitos não são aparentes ao longo de suas rotas migratórias. Vista lateral de um palco 17 srp-Gal4, uas-GFP; CRQ-Gal4, embrião uas-GFP mostrando a estrutura complicada do intestino, nesta fase de desenvolvimento (D); o início da contração muscular impede imagens ao vivo de embriões para além deste estágio de desenvolvimento. Vista ventral da etapa 13 (E) ea fase 14 (F) srp-Gal4, embriões uas vermelho stinger mostrando dispersão de hemócitos com núcleos fluorescente etiquetado. Observação de hemócitos por fluorescência em fase de 2,11 do protocolo é um pré-requisito para obtenção de imagens excelentes; anterior está à direita de todas as imagens.
Figura 3. Montagem de embriões em um prato Petriperm / Lumox.
Duas lamínulas 18x18mm (espessura 1) estão presos à face inferior do prato Petriperm usando uma pequena gota de óleo, separados por cerca de um centímetro, como mostrado. Embriões são então alinhadas lado ventral com seu eixo longo (ântero-posterior) para as bordas das lamínulas e coberto com uma pequena gota de óleo. Depois que o óleo se espalhou para preencher a lacuna entre as duas lamínulas uma lamela terceiro (18x18mm espessura 1) é gentilmente colocada em cima dos embriões de óleo coberto com as duas lamínulas previamente aderido como uma ponte para evitar os embriões de ser esmagado. Esta lamela é então colada às duas pontes lamela usando duas pequenas gotas de unha polonês. Uma vez definido, os embriões podem ser visualizados num microscópio vertical ou invertida com a lente objetiva com foco para baixo através da lamela (ao contrário através da membrana Petriperm).
Figura 4. Resultados representativos de imagens ao vivo de hemócitos GFP rotulados.
Z-projeções de hemócitos no lado ventral de um estágio 14 srp-Gal4, uas-GFP; CRQ-Gal4, embrião uas-GFP (AB). (A) é uma imagem de menor ampliação, como as utilizadas para monitorar hemócitos migrações de desenvolvimento em filmes timelapse. (B) é uma ampliação maior ainda de hemócitos na linha média ventral, mostrando detalhes de sua morfologia. (C) é uma fatia única m 1 de hemócitos na linha média ventral em um estágio 14 srp-Gal4, uas-GFP / +; CRQ-Gal4, uas-GFP / + embrião, revelando que menor número de cópias de Gal4 motoristas e uas construções também são suficientes para gerar boas imagens. (D) exibe uma z-projeção de hemócitos em um estágio CRQ-14 Gal4, embrião uas-GFP. Aqui saliências hemócitos são menos óbvios devido à menor expressão da GFP, mas ainda é possível fazer filmes e acompanhar a migração hemócitos com esta combinação de Gal4 motorista e uas construir. Imagens foram obtidas em um microscópio confocal LSM510 Leica; anterior é em todas as imagens, os anéis na periferia de imagens são causadas por vitelínico autofluorescência membrana.
Figura 5. Resultados representativos de imagens ao vivo de hemócitos GMA expressar.
Z-projeções de hemócitos na linha média ventral do estágio 13 (A) e estágio 14 (B) srp-Gal4, uas-GMA embriões, retiradas de filmes timelapse para mostrar as migrações de desenvolvimento de hemócitos. Informações detalhadas sobre a dinâmica de actina pode ser obtido por imagem maior ampliação de hemócitos GMA expressar (C). GMA consiste de GFP fundida ao domínio de ligação de actina dos filamentos de actina moesin e etiquetas. Anterior é em todas as imagens, as imagens foram tiradas em um microscópio confocal.
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Discussion
Os elementos mais importantes deste processo são a seleção de embriões saudáveis com hemócitos claramente identificados e montá-los sem danificá-los com cuidado. Uma vez que os embriões são no óleo halocarbonos são resistentes à desidratação e uma vez montada pode ser trabalhada por várias horas. Em nossas mãos, podemos hemócitos imagem para três horas, com desidratação insignificante do embrião ou do óbvio foto danos, tendo um z-stack de imagens a cada três minutos no nosso microscópio confocal Zeiss LSM510 com uma objetiva de 40X. Desde hemócitos são altamente dinâmicos pode haver um trade-off entre resolução espacial e temporal: se uma imagem de muito alta resolução é necessária a hemócitos e estruturas dentro dele podem se mover durante o exame. Os detalhes precisos de como as imagens são posteriormente coletados serão determinados pelas questões experimentais a serem abordados.
Normalmente usamos uas-GFP ou uas-GMA 3 a hemócitos rótulo; uas-GMA é particularmente útil, pois, além de hemócitos de marcação, ele fornece uma leitura de actina, filamento dinâmica. Uas outras construções podem ser usadas para investigar o comportamento hemócitos: por exemplo uas-cereja constrói 9 pode ser explorado como alternativa ou fluoróforos uas-tau-GFP 10 poderia ser usado para visualizar os microtúbulos dentro de um hemócitos. Uas constrói com uma etiqueta nuclear pode ser particularmente valiosa para o rastreamento automático de movimentos de hemócitos (Figura 2E-F). Duas cores de imagens também é possível (por exemplo, um rótulo pode tanto actina do citoesqueleto de microtúbulos e usando uas-cereja-moesin e uas-tau-GFP, respectivamente, sob o controle de um hemócitos específicos Gal4 driver). Como mencionado anteriormente, um factor determinante na geração de imagens ao vivo de hemócitos é o driver Gal4 empregados: no que diz respeito aos atuais hemócitos específicos promotores srp-Gal4 2> CRQ-Gal4 11> PXn Gal4-4, com apenas srp-Gal4 suficiente para hemócitos rótulo quando heterozigotos, enquanto que, pelo menos, duas cópias do CRQ-Gal4 ou PXn-Gal4 são necessários para observar hemócitos ao vivo. No entanto imagem ideal com srp-Gal4 requer homozigotia (ou a presença de um driver Gal4 alternativa).
Por hemócitos após viver desta forma é possível estudar sua dispersão de desenvolvimento da cabeça 8 e observar como eles interagem com o processo de pistas que esse padrão, depósito matriz e corpos apoptóticos engolir. Hemócitos representam também um interessante sistema com o qual a sonda a maquinaria de migração celular; examinando a migração dos hemócitos em embriões que não possuem componentes do citoesqueleto de actina ou microtúbulos é possível compreender a sua função in vivo de forma mais clara (por exemplo, Rho GTPases 4, 12). Exploração de uas constrói para rotular esses citoesqueleto fornece ainda informações mais detalhadas sobre sua regulamentação.
Nós modificamos esta técnica para investigar o comportamento hemócitos em uma variedade de contextos como suas respostas ao induzida por laser wounds4 e injeção de bactérias fluorescente etiquetado 13. Além disso, este método pode ser facilmente adaptado para outros tipos de imagens de células, escolhendo diferentes Gal4 drivers. Por exemplo, temos anteriormente imaginado fechamento dorsal usando epiteliais Gal4 motoristas 14, 15. A aplicação desta técnica para outros tipos de células é limitada pela força do condutor Gal4, a posição das células a ser trabalhada dentro do embrião e do tipo de microscópio usado para geração de imagens; microscópios confocal multifotônica habilitar o usuário para o comportamento das imagens das células profundas dentro do embrião (por exemplo, migração de células germinativas transepitelial 16), enquanto que microscópios confocal convencionais são incapazes de chegar a estas profundidades (é por isso que imagem ao longo da linha mediana ventral, onde hemócitos são muito superficiais, preso entre o cordão nervoso ventral desenvolvimento e epiderme).
A força deste protocolo é que ele fornece um ambiente para manter os embriões em uma condição saudável para geração de imagens ao vivo. Enquanto um grau de destreza manual é necessário para posicionar os embriões, é uma técnica fácil de dominar e rapidamente dá resultados reproduzíveis e podem ser facilmente modificados usando diferentes Gal4 motoristas e constrói uas para investigar diversos aspectos da biologia hemócitos. Além disso, o protocolo não está restrito a hemócitos desde o uso de alternativas Gal4 motoristas permite que o comportamento de outros tipos de tecido a ser analisado.
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Acknowledgments
Este protocolo foi desenvolvido através de nosso trabalho dentro e em colaboração com os laboratórios de Paul Martin e Antonio Jacinto. Agradecemos ao Centro de Ações Bloomington pelo seu excelente serviço e da comunidade Drosophila para continuar compartilhando linhas de voar. BS é atualmente financiado por uma doação do projeto BBSRC. WW é financiado por uma bolsa de Desenvolvimento de Carreira Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70μm pores |
| Halcarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt Ltd | 96077305 |
References
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