Summary
Drosophila hemocyter sprida över hela det växande embryot. Detta protokoll visar hur du monterar och bild dessa vandringar med hjälp av embryon med fluorescerande hemocyter.
Abstract
Många studier adress cell migration med
Protocol
Förberedelser
- Skaffa lämplig Drosophila rader som innehåller ett hemocyte-specifik Gal4 föraren (t.ex. SRP-Gal4 2) och ett genetiskt kodade fluorescerande reporter i UAS kontroll (t.ex. UAS-GFP). Flugor homozygota för SRP-Gal4, UAS-GMA 3 eller crq-Gal4, UAS-GFP 4, 5 är särskilt användbara för bildhantering ändamål (OBS GMA är GFP smält till aktin-bindande domän moesin), se nedan för en diskussion av utbudet av Gal4 förare och UAS konstruerar tillgängliga (Bloomington Stock Centrum innehåller en mängd olika).
- Normalt genetiska korsningar utförs så att muterade alleler är balanserade med fluorescerande balancers CTG eller TTG 6, med Gal4 förare och UAS bygger transporteras på alternativa homologa kromosomer. Detta gör det möjligt att välja homozygota mutanter på grund av frånvaron av CTG / TTG-associerade GFP fluorescens (detta görs i etapp 2,11).
- Förstärk lager och flugor plats i en om bur med en äppeljuice agarplatta 7. Flugorna behöver minst två dagar att acklimatisera till om buren innan tillräckligt embryon börjar läggas. I allmänhet twenty flugor av varje kön skall vara tillräcklig för att generera tillräckligt med embryon för bildbehandling, men det bör noteras att olika linjer har olika grader av fruktsamhet. Vi använder 55 mm petriskålar som passar in i botten av en plastbägare, punkterade vid basen så att luftflödet. Den exakta innebär insamlingen av embryon är oviktigt, men tiderna är kritiska för att samla in korrekt iscensatt embryon.
- Samla embryon från en övernattning äppeljuice agarplatta hålls vid 25 ° C eller från en tidsinställd platta. För den senare vi tillåter vanligtvis flyger till låg på en förvärmda plattan i 4 timmar, innan du tar bort plattan och placera den vid 18 ° C i 15-16 timmar före montering av embryon, detta ger embryon från sent 12 genom att arrangera 15 av utvecklingen. En övernattning plattan innehåller en större mångfald av stadier, men erbjuder fördelen av högre nivåer av fluorescerande reporter uttryck i hemocyter på grund av en längre tid vid 25 ° C som Gal4-UAS är temperaturkänsliga.
Förfarande
- Få bort embryon från äppeljuice agarplatta med en liten mängd vatten och en mjuk spets pensel. Lossnat embryon kan ses lätt med blotta ögat.
- Överför embryon till en cell sil (Fisher) eller hemgjorda korgen 7 genom att hälla vatten från äppeljuice agarplatta i korgen hålls över en bägare för att samla in avloppsvatten.
- Upprepa steg 2,2 tills du är nöjd du har tillräckligt med embryon från äppeljuice agarplatta.
- Tvätta embryon i cell sil / korg med vatten.
- Placera cellen sil / korg i petriskål locket på äppeljuice agarplatta och lägger nog snyggt blekmedel att avbryta embryon i cellen silen / korg.
- Följ dechorionation av embryon på en dissekering mikroskop under brightfield: dechorionation är klar när ryggfenan bihang har lösts upp, vilket bör ske inom två minuter.
- Ta bort celler sil / korg som innehåller embryon från blekmedel och tvätta bort kvarvarande blekmedel med vatten. Alla spår av blekmedel bör tas bort innan du fortsätter till steg 2,8. Ett knep för att bedöma om alla blekmedel har tagits bort är att utplåna ut resterande vatten på blå-färgade laboratorium vävnader - om det finns kvarvarande bleka blå färgen kommer att vara blekt vitt / rosa.
- Blot av kvarvarande vatten med hjälp av laboratorium vävnad / mediwipes tillämpas på undersidan av cellen silen / korg.
- Placera en droppe vatten i en petriskål lock. Med en fin pensel, samla alla dechorionated embryon från embryot korgen och återsuspendera dem i droppen. Nästa torka embryon genom aspirera vatten med en mikropipett eller försiktigt absorbera den med ett laboratorium vävnad / mediwipes.
- När embryon har torkat, lägg en droppe voltalef olja för att täcka alla embryon. Sätt en andra liten droppe olja i anslutning till droppe innehåller embryon. OBS vi har inte hittat ett brittiskt leverantör av voltalef olja, Halocarbon olja 700 (Sigma) kan användas istället.
- Enligt en fluorescerande dissektion mikroskop välja lämpligt iscensatt embryon av önskad genotyp hjälp av ett par urmakare peang (nummer 5) från oljan droppen. Dessa pincett ska böjas inåt (figur 1) för att ösa upp de embryon utan att punktera deras vitelline membran. Överföring utvalda embryon till den andra oljan droppen. Det är viktigt att du kan se fluorescerande hemocyter på dissekera mikroskop för att kunna samla in goda bilder på konfokalmikroskop (Figur 2). Vi monterar typiskt skede 13/14 embryon till bild sidled migration av hemocyter på den ventrala mittlinjen eller stadium 15 embryonatt bilden motilitet hemocyter efter spridning över embryot.
- Stick två täckglas (18x18mm, tjocklek 1) på undersidan av en Petriperm / Lumox skål (Sarstedt), med 2 små droppar voltalef olja och lämnar cirka 1 cm mellan dem (figur 3), dessa kommer att användas för att stödja ett täckglas placeras över embryon, för att inte krossa dem. Petriperm rätter (50 mm diameter) innehåller en hydrofob, gas-membran. Vi finner att disken blir enklare att använda när de har använts flera gånger (rätter kan torkas av med 70% etanol och återanvändas).
- Enligt brightfield på dissekering mikroskop, plocka upp utvalda embryon en efter en med böjd pincett och linje dem ventrala uppåt och parallellt med kanten av täckglas (Figur 3). Det är möjligt att anpassa upp till 15 embryon på detta sätt, beroende på din skicklighet och ditt tålamod. Det är viktigt att manipulera embryon försiktigt eftersom både embryon och Petriperm maträtt membran är ömtåliga och kan lätt spruckit.
- När embryona är justerade lägga en liten droppe olja och låt det sprida sig att skapa en homogen lager mellan de två täckglas. Efter att oljan har spridit sig (detta kan ta några minuter) kontrollera att embryona fortfarande ventrala sidan uppåt. Om embryona har rullat något, flytta dem igen med pincett.
- Slutligen, med hjälp av pincett (nummer 3) placera ett täckglas (18x18mm, tjocklek 1) över embryon, som vilar på de två tidigare levt täckglas. Limma detta täckglas till täckglas stöder med nagellack (Figur 3).
- Ta Petriperm skålen med monterad embryon till konfokala eller brett fält mikroskop och montera Petriperm maträtt på scenen med hjälp av en lämplig adapter. Antingen en upprätt eller inverterat mikroskop kan användas med objektiv som fokuserar genom täckglas (i motsats till genom membranet).
Representativt resultat:
Detta protokoll beskriver hur man monterar Drosophila embryon för live avbildning av hemocyter på den ventrala sidan av embryot. Om det görs på rätt sätt blir det enkelt att generera antingen stillbilder eller filmer av hemocyter. Den avgörande faktorn är det mikroskop som används för att bilden hemocyter (särskilt objektiv), men vilken typ av förvärvade bilderna kommer också att bero på utvecklingsstadiet, embryona temperaturen höjdes i och Gal4 och UAS linjer som används.
Högre nivåer av fluorescerande proteinet uttryck gör hemocyter att avbildas med större lätthet, därför är det viktigt att kunna se hemocyter när embryona i etapp 2,11 av protokollet (figur 2 innehåller exempel på tydliga hemocyter inom embryon som tagits med en Kameran monteras på en dissektion mikroskop). Därför ökat antal Gal4 och UAS konstruerar möjliggöra en större signal-brus-förhållande. Vidare detta minskar behovet av en hög laser intensiteter eller ökad exponeringstid då avbildning, vilket i sin tur gör hemocyte beteende som skall följas under längre perioder.
Mycket höga halter av GFP uttryck kommer att visa upp fina detaljer i hemocyte morfologi, särskilt tunnplåt-liknande lameller som omger den runda cellkroppen (Figur 4A-B). Cirkulär regioner utom GFP representerar phagosomes (Figur 4A-C). Finger-liknande filopodia kan också ses som härrör från de lameller (Figur 4B). Två Gal4 förare vara tillräcklig för att se dessa processer (Figur 4C), särskilt om en eller flera är SRP-Gal4 (se diskussion), dock långsammare scanningshastigheter eller större lasereffekt på konfokalmikroskop kan krävas. Som uttryck-nivån blir det svårare att bilden piggarna på hemocyter, ändå är det fortfarande möjligt att spåra migration av hemocyter under dessa villkor som cellkroppen är uppenbar även när utstickande delar är mindre tydlig (Figur 4D).
Vid tidigare utvecklingsstadier (upp till steg 13) hemocyter vandrar i nära kontakt med varandra och det är ofta svårt att särskilja enskilda celler. I slutet av etapp 13 hemocyter har bildat en enda linje ner den ventrala mittlinjen (Figur 5A) då blir mer rörliga, vandrar i sidled till kanterna av den ventrala nerv sladd (Figur 5B). Den aktin cytoskelettet inom dynamiska piggarna på hemocyter kan observeras direkt genom uttryck för GMA (Figur 5C) eller cherry-moesin.
Montering av embryon på detta sätt låter gasutbyte och förhindrar uttorkning och embryon förbli lönsamma efter avbildning. Om embryot skadas under monteringen är det i allmänhet uppenbart som ett embryo innehållet kommer att läcka genom dess vitelline membran. Om ett embryo börjar att torka då detta kan ofta ses av deformationer i vitelline membran. Ibland ett embryo kommer att rulla under en timelapse film, men detta brukar endast vara problematisk för längre tid filmer. Lastly, montering flera embryon på en gång ger experimentalist den bästa chansen att få ett embryo i den perfekta orientering för sina experiment.
Figur 1. Pincett för manipulering av dechorionated embryon.
De tips av urmakare peang (storlek nummer 5) ska vara böjda inåt för att mode ett verktyg för att ösa upp embryon som visas här. Den yttre yta böjda regionen är också lämpligt att behandla embryon när positionering på Petriperm membranet eftersom de har några vassa kanter som kan punktera embryot.
Figur 2. Bilderna är av embryon som kommer att ge bra live imaging resultat.
Bilder av dechorionated embryon voltalef olja (i steg 2,11 i protokollet) fått en fluorescerande dissekera mikroskop. Lateral utsikt över scenen 13 (A) och steg 15 (B) SRP-Gal4, UAS-GFP, crq-Gal4, UAS-GFP embryon. Lateral vy av en etapp 15 SRP-Gal4, UAS-GFP / +; crq-Gal4, uas-GFP/uas-N17Rac embryo (C) i vilken hemocyter har misslyckats med att flytta ut ur huvudet, som visar hur embryon ser ut när hemocyter är inte uppenbart längs sina flyttvägar. Lateral vy av en etapp 17 SRP-Gal4, UAS-GFP, crq-Gal4, UAS-GFP embryo visar invecklade strukturen i tarmen i detta skede av utveckling (D), uppkomsten av muskelkontraktion förhindrar Bildproduktion av embryon utöver detta utvecklingsstadium. Ventrala utsikt över scenen 13 (E) och stadium 14 (F) SRP-Gal4, UAS-röd Stinger embryon som visar spridningen av hemocyter med fluorescerande kärnor. Observation av hemocyter av fluorescens i etapp 2,11 i protokollet är en förutsättning för att få bra bilder; främre är till höger för alla bilder.
Figur 3. Montering av embryon på en Petriperm / Lumox maträtt.
Två 18x18mm täckglas (tjocklek 1) sitter fast i botten inför den Petriperm skålen med en liten droppe olja, separerade med ca 1 cm som visas. Embryon sedan uppradade ventralsidan upp med sina långa (främre-bakre) axel parallell med kanterna på täckglas och täckt med en liten droppe olja. När oljan har spridit sig för att fylla gapet mellan de två täckglas tredjedel täckglas (18x18mm tjocklek 1) är försiktigt placerad på toppen av oljan täckta embryon med hjälp av de två tidigare levt täckglas som en bro för att förhindra att embryon från att vara klämd. Detta täckglas är sedan limmas på två täckglas broar med hjälp av två små droppar nagellack. Efter inställningen kan embryona avbildas på en upprätt eller inverterat mikroskop med objektiv som fokuserar ner genom täckglas (i motsats till genom Petriperm membranet).
Figur 4. Representativa resultat från levande avbildning av GFP märkt hemocyter.
Z-projektioner av hemocyter på den ventrala sidan av ett stadium 14 SRP-Gal4, UAS-GFP, crq-Gal4, UAS-GFP embryo (AB). (A) är en lägre förstoring bild som används för att övervaka hemocyte utvecklande vandringar i Timelapse filmer. (B) är en högre förstoring fortfarande hemocyter på den ventrala mittlinjen, visar fina detaljer av deras morfologi. (C) är en 1 m skiva hemocyter på den ventrala mittlinjen i ett skede 14 SRP-Gal4, UAS-GFP / +; crq-Gal4, UAS-GFP / + embryo, och avslöjar att sänka antalet kopior av Gal4 förare och UAS konstruktioner är också tillräcklig för att skapa bra bilder. (D) visar ett z-projektion av hemocyter i ett skede 14 crq-Gal4, UAS-GFP embryo. Här hemocyte utstickande delar är mindre uppenbara på grund av lägre uttryck av GFP, men det är fortfarande möjligt att göra filmer och spåra hemocyte migration med denna kombination av Gal4 förare och UAS konstruktion. Bilderna togs på en Leica LSM510 konfokalmikroskop, främre är upp i alla bilder; ringarna i utkanten av bilderna orsakas av vitelline membran autofluorescens.
Figur 5. Representativa resultat från levande avbildning av GMA uttrycka hemocyter.
Z-projektioner av hemocyter på den ventrala mittlinjen stadium 13 (A) och steg 14 (B) SRP-Gal4, UAS-GMA embryon som tagits från timelapse filmer att visa utvecklande migreringar av hemocyter. Detaljerad information om aktin dynamik kan erhållas genom högre förstoring avbildning av GMA uttrycka hemocyter (C). GMA består av GFP smält till aktin-bindande domän moesin och etiketter aktin filament. Främre är upp i alla bilder, bilder som togs på en konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste delarna i detta förfarande är urvalet av friska embryon med tydligt märkta hemocyter och att montera dem försiktigt utan att skada dem. När embryon i Halocarbon olja de är resistenta mot uttorkning och en gång monterade kan avbildas i flera timmar. I våra händer kan vi bilden hemocyter i tre timmar, med försumbar uttorkning av embryo eller tydliga foto-skador, med ett z-stack av bilder var tredje minut på vår Zeiss LSM510 konfokalmikroskop med 40X objektiv. Eftersom hemocyter mycket dynamiska det kan en avvägning mellan tidsmässiga och geografiska: om en mycket högupplöst bild krävs det hemocyte och strukturer inom det kan röra sig under genomsökningen. De exakta detaljerna i hur bilderna sedan samlas in kommer att avgöras av den experimentella frågor som måste lösas.
Vi använder vanligtvis UAS-GFP eller UAS-GMA 3 för att märka hemocyter, UAS-GMA är särskilt användbart eftersom, förutom märkning hemocyter, det ger en avläsning av aktin filament dynamik. Andra UAS konstruktioner kan användas för att sonden hemocyte beteende: till exempel UAS-körsbär konstruktioner 9 kan utnyttjas som alternativ fluoroforer eller UAS-tau-GFP 10 kan användas för att visualisera mikrotubuli i en hemocyte. UAS konstruerar med en nukleär märkning kan vara särskilt värdefullt för automatiserad spårning av hemocyte rörelser (Figur 2E-F). Två färgbilder är också möjligt (t.ex. en kan märka både aktin och cytoskeletons microtubule med UAS-cherry-moesin och UAS-tau-GFP, respektive under kontroll av en hemocyte-specifika Gal4 förare). Som tidigare nämnts är en avgörande faktor i levande bilder av hemocyter de Gal4 föraren anställda: när det gäller nuvarande hemocyte specifika initiativtagare SRP-Gal4 2> crq-Gal4 11> pxn-Gal4 4, med endast SRP-Gal4 tillräckligt för att märka hemocyter när heterozygota, medan minst två kopior av crq-Gal4 eller pxn-Gal4 behövs för att observera hemocyter leva. Trots optimal avbildning med SRP-Gal4 kräver homozygosity (eller förekomsten av en alternativ Gal4 förare).
Genom att följa hemocyter leva på detta sätt är det möjligt att studera deras utveckling spridning från huvudet 8 och observera hur de interagerar med de ledtrådar som mönstret denna process, deposition matris och uppsluka apoptotiska kroppar. Hemocyter utgör också ett intressant system som man kan söka av maskiner av cell migration, genom att undersöka migration av hemocyter i embryon som saknar delar av aktin och mikrotubuli cytoskeletons är det möjligt att förstå deras in vivo-funktionen mer tydligt (t.ex. Rho GTPases 4, 12). Utnyttjande av UAS konstruktioner för att märka dessa cytoskeletons ger ännu mer detaljerad information om deras reglering.
Vi har ändrat denna teknik för att undersöka hemocyte beteende i olika sammanhang som deras svar på laserinducerad wounds4 och injektion av fluorescerande bakterier 13. Även denna metod kan enkelt anpassas till bilden andra celltyper genom att välja olika Gal4 förare. Till exempel har vi tidigare avbildas rygg stängning med hjälp av epiteliala Gal4 drivrutiner 14, 15. Tillämpningen av denna teknik till andra celltyper begränsas av styrkan i den Gal4 föraren, position celler som skall avbildas i embryot och den typ av mikroskop som används för avbildning; multiphoton konfokala mikroskop gör det möjligt för användaren att bilden cellens beteende djup inom embryot (t.ex. könsceller transepithelial migration 16), medan konventionella konfokala mikroskop inte kan nå dessa djup (det är därför vi bilden längs den ventrala mittlinjen där hemocyter är väldigt ytliga, fångade mellan u ventrala nerv sladd och överhuden).
Styrkan i detta protokoll är att det ger en miljö för att upprätthålla embryon i ett friskt tillstånd för live avbildning. Även om en viss fingerfärdighet krävs för att placera embryon, det är en enkel teknik att bemästra och snabbt ger reproducerbara resultat och kan enkelt ändras med hjälp av olika Gal4 förare och UAS konstruktioner för att undersöka många olika aspekter av hemocyte biologi. Dessutom är protokollet inte begränsad till hemocyter eftersom användning av alternativa Gal4 förare gör beteende typer av vävnad som skall analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta protokoll har utvecklats genom vårt arbete inom och i samarbete med laboratorier av Paul Martin och Antonio Jacinto. Vi tackar Bloomington Stock centrum för sin utmärkta service och den Drosophila community för att fortsätta dela flyga linjer. BS är för närvarande finansieras genom en BBSRC projektbidrag. WW är finansierad av ett Wellcome Trust Career Development Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70μm pores |
| Halcarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt Ltd | 96077305 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
