الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

Summary

فحوصات الجينات qPCR التعبير هي رواية سولاريس مصمم مسبقا qPCR التمهيدي / مسبار تركيبات المصممة لتبسيط عملية qPCR دون التضحية خصوصية ومتانة مقايسة.

Abstract

الجينات qPCR سولاريس الفحص التعبير هو نوع من الرواية التمهيدي / المسبار مجموعة ، وتهدف إلى تبسيط عملية qPCR مع الحفاظ على حساسية ودقة الفحص. وهذه المجموعات التمهيدي / المسبار مصمم مسبقا على 98 ٪> من الجينوم البشري والفأر والتحسينات ميزة كبيرة من التكنولوجيات المتاحة سابقا. وقد جاءت هذه التحسينات الممكنة بحكم رواية خوارزمية التصميم الذي وضعه خبراء المعلوماتية الحيوية الحرارية العلمية.

وأدرجت العديد من المزايا المريحة في الفحص qPCR سولاريس لتبسيط عملية تنفيذ الكمية في الوقت الحقيقي PCR. أولا ، بروتوكول مماثل إلى البدائل استخداما ، لذلك فإن الأساليب المستخدمة خلال qPCR من المحتمل أن تكون مألوفة. الثاني ، هو مزيج الرئيسي الأزرق ، الأمر الذي يجعل تحديد ردود الفعل qPCR أسهل لتعقب. الثالثة ، والظروف الدراجات الحرارية هي نفسها بالنسبة للجميع المقايسات (الجينات) ، مما يجعل من الممكن لتشغيل كثير من العينات في وقت واحد والحد من احتمالات الخطأ. أخيرا ، تقدم لجنة التحقيق التمهيدي وتسلسل المعلومات ، وتبسيط عملية النشر.

هنا ، ونحن لشرح كيفية الحصول على الكواشف المناسبة سولاريس البحث باستخدام ميزة المنتج GENEius العثور على موقع على شبكة الإنترنت بسهولة (www.thermo.com / سولاريس) وكيفية استخدام الكواشف سولاريس لأداء qPCR باستخدام أسلوب منحنى القياسية.

Protocol

1. الفحص العلمي الحرارية qPCR سولاريس تصميم الخوارزميات

1. الخوارزمية المستخدمة في تصميم المسبار أزواج سولاريس / التمهيدي qPCR يضبط تيم كل مكون وبالتالي تمكين الدراجات ظروف عالمية. إدماج MGB ، أو ثانوية ملزمة الأخدود ، شاردة في التحقيق يزيد من تيم ويسمح للأقصر تحقيقات لتكون مصممة لمرونة أكبر وأداء الفحص. كما يوحي الاسم ، MGBs هي فئة من المضادات الحيوية التي يمكن أن تندرج في أخدود صغير من الحمض النووي الحلزون. وترد MGBs إلى نهاية 3 أو 5 من مسبار الحمض النووي. في الحل ، وتطفئ مضان مراسل FAM لجنة التحقيق التي فاكهه تقضي الكسوف المظلمة. عند التحقيق يربط تسلسل الهدف ، مما أدى إلى تغيير التشكل 3 - D التحقيق ق يسمح إشارة قوية الفلورسنت. واستقرت الملزمة لتحقيق الهدف تسلسل الحمض النووي لمن MGB ، والذي يسمح باستخدام المجسات ومحددة للغاية أقصر مع الحفاظ على درجة حرارة مناسبة للذوبان PCR. وهكذا ، كشف إشارة يحدث خلال مرحلة الصلب من التضخيم الهدف. خلال خطوة التمديد ، التحقيق MGB ينأى وتطفئ مرة أخرى مضان. لأن ينأى التحقيق ، فإنه لا يؤثر على كفاءة PCR.
2. ميزة أخرى من الخوارزمية سولاريس هو استخدام Superbases. يتم تعديل Superbases القواعد التي عززت قدرات ملزمة لتحسين الاستقرار والقضاء على السندات AT GG الذاتي الجمعيات في متواليات الغنية جوانين. وعلاوة على ذلك ، فإنها لا يشفي fluorophores المتاخمة المرفقة في نهاية 5. يتم وضع هذه القواعد بشكل انتقائي ، وفقا لخوارزمية ، لتوسيع نطاق توافر سلاسل الهدف. وهذا يجعل من الممكن استخدام متواليات ، مثل المناطق GC الغنية ، التي لولاها يمكن تجنبها في تصميم أجهزة الاشعال وتحقيقات.
3. كلما كان ذلك ممكنا ، الخوارزمية سولاريس يضم مناطق تقاطع اكسون الممتدة في الموقع المستهدف. هذا يزيد من خصوصية من خلال تجنب التضخيم من الحمض النووي الجينومي الملوثات.
4. الأهم من ذلك ، الخوارزمية يحدد أيضا سلسلة الآراء لجميع المتغيرات لصق المعروفة ، بحيث يتم تغطية كل واحدة من قبل المسبار / مجموعة التمهيدي. لذا ، لا بد من فحص واحد فقط لجينة معينة من الفائدة.
5. وأخيرا ، فإن الفحص qPCR سولاريس تصميم خوارزمية تستخدم المعلمات صارمة للغاية لاعتبارات التصميم الحرجة بما في ذلك المحتوى GC ، وطولها ، TM ، وتمتد من النيوكليوتيدات متجانسة. تسلسل الناتجة BLAST تحليلها لخصوصية استخدام 3 قواعد بيانات مختلفة : الجينومية ، نص ، وجين كاذب.

2. الحصول على الكواشف سولاريس

1. للحصول على سولاريس الكواشف المناسبة ، يمكنك زيارة www.thermo.com / سولاريس
2. مرة واحدة في الموقع انقر على "البحث عن منتج GENEius". للذهاب مباشرة إلى البحث GENEius المنتج ، انتقل إلى www.thermo.com / SolarisSearch
3. انقر في مربع البحث والتحري في اختيار الكائن المستهدف المناسبة.
4. لا يمكن للبحث العديد من المنتجات GENEius عملية معرفات الجينات المختلفة. هنا ، تدخل أحد مصطلحات البحث للعثور على واقترح الجينات في المصالح ، بما في ذلك المرجع تسلسل الانضمام ، معرف الجينات ، والرمز الجيني ، ووصف جين ، معرف أو رقم سانجر الانضمام ، أو رقم الكتالوج. ثم انقر على "بحث".
5. التعرف على الجينات في المصالح والضغط على "اختيار" على الجانب الأيسر. وهذا فتح إطار يعرض مختلف المنتجات الحرارية العلمية المتاحة لهذا الجين من الفائدة. تحت عنوان "المنتجات" حدد "الكشف qPCR" الجدولة.
6. تحت عنوان "سولاريس الفحص التعبير الجيني" العنوان ، سترى أخرى مصممة بشكل أمثل سولاريس المسبار / الفحص التمهيدي. وهذا الاختبار غطاء واحد من كل المتغيرات لصق الجين المعروف الهدف الخاص بك. اختر الكمية المطلوبة. فهي متوفرة في 100 ، 400 ، 200 ، و
   1000 X 25 التفاعلات ميكرولتر (إذا حددت مقايسة والتي هي من صنع النظام إلى أن حجم حزمة 100 لن تكون متاحة). بالنقر على "أضف إلى السلة".
7. المقبل ، حدد المزيج المناسب للسيد cycler الحرارية التي سيتم استخدامها. لتحديد أي مزيج رئيسية ستعمل بشكل أفضل مع الجهاز المتاحة ، انقر على "البحث عن سيد ميكس الذي يعمل بشكل أفضل مع Cycler PCR بك!"
8. العثور على cycler qPCR التي سيتم استخدامها في القائمة لتحديد أي مزيج للاستخدام.
9. عودة إلى البحث GENEius إطار المنتج ، واختيار المزيج المناسب الرئيسية. مزيج الرئيسي يأتي في 100 ، 400 ، 200 ، والأحجام رد فعل 1000. انقر على زر "إضافة إلى السلة".
10. ويمكن أيضا الإشارة الجينات اقترح ومستلزمات الصفحة اليسرى التوليف [كدنا] أن يؤمر لتحليل qRT - PCR كاملة.
11. عندما تصل qPCR الكواشف سولاريس ، وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. وينبغي أن تلقى الكواشف التالية : حل 20X تحتوي على اثنين الاشعال المقدمة في 800 نانومتر لكل منهما وتحقيق تقدم في جين معين 200 نانومتر ، sequمعلومات عن التحقيق سينعقد على حد سواء ، وأجهزة الاشعال ، وسولاريس التعبير الجيني qPCR ميكس ماجستير في تركيز 2X. سولاريس التعبير الجيني فحوصات qPCR مستقرة لمدة لا تقل عن 12 شهرا. تجنب تكرار تجميد الذوبان.

3. qPCR الإعداد

1. نبدأ مع بروتوكول qPCR [كدنا]. وينبغي استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام أسلوب عمود الدوران. وأوصت اللجنة العلمية الحرارية عدة فيرسو [كدنا] تجميع لعكس النسخ لتوليد [كدنا].
2. تحضير للذوبان والتي qPCR الشعائل وتحقيقات ، ومزيج الرئيسي على الجليد. كما تكون في متناولهم PCR المياه الصف ومبهمة لوحات qPCR البيضاء ، التي يمكن أن تحسن من حساسية في الوقت الحقيقي PCR.
3. مزيج يحتوي على جميع المكونات الرئيسية لPCR الوقت الحقيقي بما في ذلك : 1) بوليميريز الحمض النووي الحرارية ابدأ ، وإصدار الساخنة بداية بوليميريز الحمض النووي Thermoprime. ويستخدم هذا النوع من البلمرة لمنع غير محددة خلال تضخيم رد الفعل إعداد ويتطلب تفعيل الخطوة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 2) dNTPs في مزيج ماجستير سولاريس ، dTTP يستبدل dUTP لتعظيم الكفاءة التضخيم 3) رد فعل الملكية العازلة ، الأمثل للعمل مع المقايسات التمهيدي / سولاريس التحقيق. هذا رد فعل المخزن يحتوي على صبغة زرقاء لزيادة التباين بين الكاشف والبلاستيك. 4) ROX ، إذا كان الصك الخاص qPCR يتطلب ROX.
4. بمجرد أن تحسنت الحلول ، من خلال مزيج عبها الأنبوب (لا الدوامة). تدور عليهم لمنع فقدان كاشف.
5. المقبل ، وإعداد 15 مل أنبوب فالكون العقيمة لإعداد مزيج رد فعل لهذا الجين من الفائدة ، زائد واحد لهذا الجين المرجعية ، وزيادة اعتمادا على عدد من العينات. اعداد كافية من هذا القبيل يمكن ان ثلاثة مكررات تكون مستعدة لكل عينة ، بما في ذلك السيطرة قالب رقم (NTC) ، وعينات من منحنى القياسية ، إذا كان سيتم استخدام الأسلوب منحنى القياسية للتحليل.
6. لتشغيل كل عينة على طبق من ذهب 96 كذلك ، مزيج ما يلي : 5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 0.5 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة يضاف [كدنا] سيكون 25 ميكرولتر. لكل عينة تعمل على 384 لوحة مزيج جيد ما يلي : 12.5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 1.25 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة [كدنا] وسوف يتم إضافة يكون 10 ميكرولتر.
7. باستخدام pipettor متعددة القنوات ، ونقل المزيج الرئيسي إلى الآبار المناسب للوحة. والصبغة الزرقاء المدرجة في مزيج رئيسية تساعد في تتبع التقدم pipetting على لوحات بيضاء. ثم ، تضاف 1-5 قالب ميكرولتر [كدنا] (لوحة 96 أيضا) أو 1-2 ميكرولتر من قالب [كدنا] (لوحة 384 أيضا). ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. وضع لوحة في جهاز للطرد المركزي وتدور باستمرار لإزالة أي فقاعات ، وهذه سوف تتداخل مع قراءات مضان.
8. برنامج cycler الحرارية : يجب تنشيط الانزيم مع 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (1 دورة). ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية ، وتمسخ لمدة 15 ثانية ، والصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.
9. وضع لوحة في الصك qPCR. بدء تشغيل البرنامج.

ممثل النتائج qPCR باستخدام سولاريس

الشكل 1. فحوصات الكشف عن إعطاء سولاريس موثوقة حتى بتركيزات منخفضة جدا المدخلات ، والحكم على كفاءة والقيم PCR R2. تم تضخيمها عشرة أضعاف التخفيفات 10 من [كدنا] تسلسل الاصطناعية توليفها من amplicon RNA أو تسلسل الحمض النووي amplicon على صك 7900HT ABI باستخدام سولاريس التعبير الجيني للF2RL1 qPCR الفحص أو CDC20 ، على التوالي. تظهر منحنيات التضخيم سجل النطاق والمنحنيات القياسية مع أداء كل مقايسة بما في ذلك الكفاءة والقيمة R2 ، دينامية مجموعة من التخفيفات LOG10 10 ، والحد الأدنى من الكشف.

الشكل 2. فحوصات سولاريس تعطي نتائج متسقة حتى بين مختلف الباحثين والمختبرات. وtransfected siRNAs استهداف ALDOA وPPIB ، فضلا عن عدم استهداف التحكم (NTC) ، إلى خلايا هيلا في 100 نانومتر و 10 و 1 و 0.1 تركيزات النهائي. وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مجموع عزل 48 ساعة بعد تلقي العلاج. تم تصنيعه باستخدام [كدنا] الحرارية العلمية كيت فيرسو التجميعي [كدنا]. تم تضخيمها وقسامة من [كدنا] في مختبرين منفصلين جغرافيا باستخدام سولاريس التعبير الجيني qPCR فحوصات للكشف عن ALDOA ، PPIB وGAPDH على LightCycler روش 480 (384 أيضا) منصة. تم احتساب ضربة قاضية باستخدام الأسلوب ΔΔCq (لتطبيع GAPDH إشارة الجينات والخلايا المعالجة NTC). وقد برهنت على نفس مستويات ضربة قاضية للأهداف الجينات سواء بين كل من الباحثين في كلا الموقعين.

Discussion

الحرارية العلمية سولاريس qPCR توفير فحوصات بسيطة ، وطريقة محسنة لأداء تحليل qPCR. باستخدام خوارزمية عالية الصرامة ، وإدماج التكنولوجيا وSuperbases MGB ، هذه المجموعات التمهيدي وتحقيق أقصى قدر من الدقة ومتانة التجارب qPCR. واحد وتعيين التحقيق التمهيدي تعترف جميع الصيغ المعروفة للصق الجين المعطى. الموقع المستهدف ، كلما كان ذلك ممكنا ، وتشمل المناطق الممتدة اكسون ، لضمان عدم تضخيم أن الحمض النووي الجيني. هذه الميزات تجعل من الممكن لتشغيل عينات عديدة في وقت واحد ، مما يقلل كثيرا من مقدار الوقت اللازم لإجراء التجارب المعقدة. منذ الرئيسي هو مزيج الأزرق ، فمن الممكن استخدام لوحات غير شفافة بيضاء ، والتي تحسن من الحساسية للqPCR ، دون أن تفقد مسار pipetting.

اتخذت جميع معا ، ملامح تصميم الفحص qPCR سولاريس جعل هذا الاختبار qPCR رواية مقايسة بسيطة ، ولكنها عالية الأداء في آن معا محددة وقوية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics