Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

Summary

Solaris КПЦР Анализы экспрессии генов являются новыми заранее разработанных КПЦР грунт / зонд комбинаций, предназначенных для упрощения процесса КПЦР без ущерба для специфики и надежность анализа.

Abstract

Гена Solaris КПЦР Выражение Пробирной является новым типом грунта / зонд установлен, предназначенных для упрощения процесса КПЦР, сохраняя при этом чувствительность и точность анализа. Эти грунтовки / зонд наборы заранее разработанных до> 98% от человека и мыши геномы и особенности значительные улучшения по сравнению с предыдущим доступных технологий. Эти улучшения стали возможны благодаря алгоритму новый дизайн, разработанный Thermo Scientific эксперты биоинформатики.

Несколько удобных функций, которые были включены в Пробирной Solaris КПЦР рационализировать процесс выполнения количественных ПЦР в реальном времени. Во-первых, протокол похоже на обычно используемые альтернативы, так что методы, используемые во время КПЦР, вероятно, будут знакомы. Во-вторых, мастер сочетание синего цвета, что делает настройку КПЦР реакции легче отследить. В-третьих, теплового режима езды на велосипеде одинаково для всех анализов (генов), что позволяет запускать многие образцы в то время и снижает вероятность ошибки. Наконец, зонд и информации грунтовки последовательности при условии, упрощение процесса публикации.

Здесь мы показываем, как получить соответствующие реагенты Solaris использованием GENEius функцию поиска продукт найден в заказе веб-сайта (www.thermo.com / Solaris) и как использовать Solaris реагентов для выполнения КПЦР с помощью стандартного метода кривой.

Protocol

1. Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной Дизайн Алгоритм

1. Алгоритм, используемый в конструкции Solaris КПЦР зонд / пар праймеров регулирует Tm каждого компонента тем самым позволяя универсальных условий езды на велосипеде. Включение МГБ, или незначительные паз обязательными, группу в зонд увеличивает Tm и позволяет для более коротких зондов быть рассчитаны на большую гибкость и производительность анализа. Как следует из их названия, MGBs представляют собой класс антибиотиков, которые могут вписаться в малом желобе ДНК спирали. MGBs крепятся к 3 или 5 конец ДНК-зонда. В растворе флуоресценции FAM корреспондент зонд гасится Затмение Темный утоления. Когда зонд связывается с целевой последовательности, в результате изменений в 3-D конформация зонд с позволяет сильный флуоресцентный сигнал. Связывание ДНК-зонда к целевой последовательности стабилизируется МГБ, которая позволяет использовать весьма специфичны, короче зондов, сохраняя при соответствующей температуре плавления для ПЦР. Таким образом, обнаружение сигналов происходит во время отжига фазы цель усиления. Во время расширения шаг, МГБ зонд дистанцируется и флуоресценции опять угасает. Потому что зонд непричастности, это не влияет на эффективность ПЦР.
2. Еще одна особенность алгоритма Solaris является использование Superbases. Superbases изменяются баз, которые улучшили обязательных способностей для повышения стабильности AT облигаций и устранение Г. Г. самоассоциации в гуанин богатых последовательностей. Более того, они не утолить смежных флуорофоров приводится в 5 конца. Эти базы размещены выборочно, в соответствии с алгоритмом, расширить доступность целевой последовательности. Это дает возможность использовать последовательности, такие как GC богатых регионов, которые иначе были бы избегать в праймеров и зондов.
3. Когда это возможно, алгоритм Solaris включает в экзоне узел охватывает регионы в целевой сайт. Это увеличивает специфичность, избегая усиление загрязнения геномной ДНК.
4. Важно отметить, что алгоритм также определяет консенсусной последовательности для всех известных вариантов сращивания, так, что все охвачены одной зонд / грунтовка множество. Таким образом, только один анализа необходимы для конкретного гена.
5. Наконец, Пробирной Solaris КПЦР дизайн алгоритм использует очень жесткие параметры для критических соображений дизайна в том числе ГК содержания, длина, Tm, и участки однородного нуклеотидов. В результате последовательностей BLAST проанализированы на специфичность, используя 3 различных баз данных: геномные, стенограммы, и псевдогена.

2. Получение Solaris Реагенты

1. Для получения соответствующего Solaris реагентов, посетите www.thermo.com / Solaris
2. Однажды на сайт нажмите на кнопку "GENEius Поиск товара". Чтобы перейти непосредственно к GENEius поиска, перейдите на www.thermo.com / SolarisSearch
3. Щелкните в окне поиска запрос и выбрать подходящий организм цели.
4. Поиск GENEius продукт может обрабатывать множество различных идентификаторов гена. Здесь, введите один из предложенных условий поиска, чтобы найти интересующего гена, в том числе работе Seq присоединении, Гена ID, Гена Symbol, Гена Описание, ID Сэнгер или присоединение номер или номер по каталогу. Затем нажмите на кнопку "Поиск".
5. Определить интерес гена и нажмите на кнопку "Выбор" на левой стороне. Откроется окно, которое показывает различные Thermo Scientific продукты, доступные для гена. В разделе "Продукция" выберите "КПЦР Обнаружение" Tab.
6. Под "Солярис экспрессии генов пробирной" заголовок, вы увидите одну оптимальную конструкцию зонда Solaris / грунтовки анализа. Этот анализ будет охватывать все известные варианты сплайсинга вашего гена-мишени. Выбрать требуемое количество. Они доступны в 100, 200, 400 и
   1000 X 25 мкл реакции (если анализ будет идентифицирован как сделанные на заказ, 100 размер упаковки будет недоступна). Нажмите на кнопку "Добавить в корзину".
7. Далее, выберите необходимое сочетание мастер для термоциклер, который будет использоваться. Чтобы определить, какой мастер микс будет работать лучше всего с машины доступны, нажмите кнопку "Выясните, какие Master Mix лучше всего работает с вашей Cycler ПЦР!"
8. Найти КПЦР циклер, который будет использоваться в меню, чтобы определить, какое сочетание в использовании.
9. Вернуться в окно поиска продукта GENEius и выберите необходимое сочетание хозяина. Мастер смесь поставляется в 100, 200, 400 и 1000 размеров реакции. Нажмите кнопку "Добавить в корзину".
10. Предлагаемая ссылка генов и оборотной кДНК комплекты синтеза можно также заказать для полной QRT-PCR анализа.
11. Когда Solaris КПЦР реагентов приходят, хранить их при температуре -20 ° С до готовности к использованию. Следующие реагенты должны быть получены: 20X раствор, содержащий два праймера при условии, при 800 нм каждый и один ген конкретных зондом при условии, при 200 нм, sequENCE информации как для зонда и грунтовки, и Solaris КПЦР экспрессии генов Master Mix в 2 раза концентрации. Solaris КПЦР Анализы экспрессии генов стабильны в течение минимум 12 месяцев. Избегать повторного замораживания оттаивания.

3. КПЦР установки

1. Начните КПЦР протокол с кДНК. Всего РНК должны быть извлечены при помощи метода спин колонки. Thermo Scientific Verso кДНК комплект синтеза рекомендуется для обратной транскрипции для получения кДНК.
2. Подготовка к КПЦР таянием грунтов, зонды, и мастер-микс на льду. Кроме того, иметь под рукой ПЦР воды класса и непрозрачных белых пластин КПЦР, что может улучшить чувствительность ПЦР в реальном времени.
3. Мастер смесь содержит все компоненты для ПЦР в реальном времени в том числе: 1) Термо-Start ДНК-полимеразы, горячего старта версия Thermoprime ДНК-полимеразы. Этот тип полимераза используется для предотвращения неспецифического усиления в ходе реакции, настройке и требует активации шаг при 95 ° С 15 мин. 2) дНТФ в смеси Solaris Master, dTTP заменяет dUTP максимального усиления эффективности 3) Собственные буфера реакции, оптимизированный для работы с Solaris грунт / зонд анализов. Эта реакция буфер содержит синюю краску, чтобы увеличить контраст между реагентом и пластика. 4) ROX, если ваш прибор требует КПЦР ROX.
4. После решения имеют талые, перемешать, щелкая трубку (не вихря). Спиновые их вниз, чтобы предотвратить потерю реагента.
5. Далее, подготовить 15 мл стерильную пробирку Сокол создать реакционную смесь для интересующего гена, плюс один для ссылки гена, расширение масштабов в зависимости от количества образцов. Подготовка достаточно таких, что три повторяет могут быть подготовлены для каждого образца, в том числе не шаблон управления (NTC) и стандартных образцов кривой, если стандартный метод кривой будет использоваться для анализа.
6. Для каждого образца работают на 96-луночный планшет, смешайте следующие: 5 мкл 2X Solaris Mix КПЦР Master, 0,5 мкл Solaris Primer / зонда набор (20X) и ПЦР-класса водой так, что конечный объем реакции, когда-то кДНК добавляется будет 25 мкл. Для каждого образца работают на 384-луночного планшета смеси следующие: 12,5 мкл 2X Solaris Mix КПЦР Мастер, 1,25 мкл Solaris Primer / зонда набор (20X) и ПЦР-класса водой так, что конечный объем реакции, когда-то кДНК Добавлен будет 10 мкл.
7. Использование нескольких дозаторов канал, передача мастером микс на соответствующие лунки пластины. Синего красителя, включенные в мастер смесь поможет в отслеживании пипетирования прогресса в белых пластин. Затем добавьте 1-5 мкл кДНК шаблона (для 96-луночного планшета) или 1-2 мкл кДНК шаблона (для 384-луночного планшета). Внесите вверх и вниз, чтобы смешаться. Место пластины в центрифуге и спином вниз, чтобы удалить пузырьки, так как они будут мешать флуоресценции чтениях.
8. Программа термоциклер: фермент должен быть активирован с 95 ° С 15 мин (1 цикл). Затем 40 циклов 95 ° C, денатурация в течение 15 секунд, а отжиг и расширения при 60 ° С в течение 60 секунд.
9. Место пластины в приборе КПЦР. Запустите программу.

Представитель КПЦР результатов с помощью ОС Solaris

Рисунок 1. Solaris анализы дают надежное обнаружение даже при очень низких концентрациях вход, если судить по эффективности ПЦР и r2 значения. Десять 10-кратного разведения кДНК синтезировали из синтетических ампликона РНК последовательности или последовательности ДНК ампликона усиливался по инструменту ABI 7900HT использованием Solaris КПЦР Анализ экспрессии генов для F2RL1 или CDC20, соответственно. Логарифмической шкале усиления кривые и стандартные кривые приведены вместе с исполнением каждого теста в том числе эффективность, r2 значения, динамический диапазон из 10 log10 разведения, а нижний предел обнаружения.

Рисунок 2. Solaris анализы дают согласующиеся результаты даже между разными исследователями и лабораториями. siRNAs ориентации ALDOA и PPIB, а также без ориентации управления (NTC), были трансфекции в клетки HeLa при 100, 10, 1 и 0,1 нМ конечные концентрации. Клетки собирают и общей РНК, выделенной 48 часов после лечения. кДНК синтезировали использованием Thermo Scientific Verso Kit Синтез кДНК. Аликвоту кДНК амплифицировали в двух географически разделенных лабораторий, использующих Solaris КПЦР Анализы экспрессии генов для обнаружения ALDOA, PPIB и GAPDH на Рош LightCycler 480 (384-а) платформы. Нокдаун был рассчитан с использованием метода ΔΔCq (нормированная на GAPDH ссылкой гена и NTC-обработанных клеток). Же уровень нокдаун были продемонстрированы как для гена цели между двумя исследователями на обоих сайтах.

Discussion

Thermo Scientific Solaris КПЦР Анализы обеспечивают простой, улучшенный метод для выполнения КПЦР анализа. Использование высоких алгоритм строгости, включая МГБ технологии и Superbases, эти грунтовки и зонда набора максимальной точности и надежности КПЦР экспериментов. Один грунтовки и зонда набор распознает все известные сращивания вариантов данного гена. Целевой сайт, по возможности, включает в себя экзона охватывающей регионы, чтобы геномной ДНК не усиливается. Эти особенности делают возможным запуск многочисленных проб одновременно, что значительно сокращает время, необходимое для выполнения сложных экспериментов. Так как мастер сочетания синего цвета, можно использовать белые непрозрачные пластины, которые повышают чувствительность КПЦР, не теряя из пипетки.

Взятые все вместе, конструктивные особенности Пробирной Solaris КПЦР сделать этот роман анализа КПЦР простой, но высокопроизводительный анализ, который является одновременно конкретным и надежным.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics