Summary
这个协议描述KLRG1四聚体的生产,这是一个强大的工具KLRG1配体的分析。
Abstract
杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)是II型跨膜糖蛋白抑制性受体,属于C型凝集素样超家族。 KLRG1存在单体和二硫键相连的二聚体。这种保守的受体上最成熟,最近激活NK细胞,以及效应/记忆性T细胞的一个子集。
使用KLRG1四聚体,以及其他的方法,E,N,和R -钙粘素被确定为KLRG1配体。这些CA 2 +依赖的细胞,细胞粘附分子由胞外域包含五个cadherin的细胞间的相互作用,跨膜结构域和细胞质域与肌动蛋白细胞骨架的重复。
KLRG1四聚体的生成,是必不可少的KLRG1配体的识别。 KLRG1四聚体,也是一个独特的工具,以澄清在调节免疫反应和组织的完整性的作用cadherin和KLRG1发挥。
Protocol
包涵体的制备
- 接种4 × 500毫升烧瓶结核病每个过夜培养的细菌,表达KLRG1质粒构建含有50微克/ ml的羧苄青霉素和氯霉素。当外径达到0.6 A,在600 nm与0.4 M IPTG诱导,并在37孵育一个附加的4小时晃动文化° C。
- 中提取的干细胞重悬在再悬浮缓冲液的pH值= 8.0(50 25%(W / V)蔗糖,1 mM的EDTA,MM的Tris - HCl,10 mM的数码地面电视)。注:颗粒可以在这个阶段被冻结。
- 池不超过60毫升细菌resuspensions的聚丙烯烧杯。如果有必要调整到60毫升,用TE缓冲液pH值8.0,并在半速搅拌混合。
- 以搅拌混合添加下降明智的:溶菌酶(终= 1毫克/毫升),氯化镁(终= 5毫米),2毫克DNA酶我包含在50%的甘油75毫米氯化钠,TRITON - X100(最终= 1%),数码地面电视(最终= 10毫米)。
- 超声冰1.5分的解决方案,并在10分钟5000转离心裂解液在4 ° C。
- 倾倒上清液。
- 添加15毫升的洗涤缓冲液的pH值= 8.0(50毫米的Tris - HCl,0.5%Triton X - 100的的氯化钠,100毫米,1毫米EDTA,1 mM的数码地面电视)。
- 在冰上,超声1.5分钟的解决方案,直到沉淀完全重悬。
- 10分钟5000转离心样品在4 ° C。
- 重复洗5次。
- 洗没有TRITON X - 100,离心机和4毫升TE缓冲液中的悬浮缓冲液重复5B。
- 以湿重包涵体浆在30至100毫克/毫升的浓度,并存储在TE缓冲液。
复性KLRG1
- 1 L复性缓冲液pH = 8.0(0.4 M精氨酸盐酸的0.1 M Tris pH值8-8.3,2毫米EDTA,0.2毫米PMSF,EDTA - 免费蛋白酶抑制剂药片,5毫米GSH和0.5毫米的GSSG)和寒意到4 ° C,边搅拌。
- 准备注入折叠混合物包涵体:这是非常理想,使每5 10注射用0.25 0.5微米的浓度,使终浓度的蛋白质将于2 3微米。
- 融化10毫米的β-巯基乙醇50毫克包涵体浆量在7米GnHCl。
- 保持包涵体/ GnHCl混合物在37 ° C为30 - 40分钟和涡每5分钟,以确保完全融化(完全融化时,泥浆就会清楚)。
- 离心机最大速度离心30分钟在4 ° C,将上清转移至15 mL离心管。做不转让任何黑色的小颗粒。
- 注射缓冲液(3米GnHCl,10毫米NaAcetate mM的EDTA,pH值4.2,10),调整音量。
- 注入1毫升稀释后的包涵体每隔一小时。注射时,在高速搅拌,添加1毫升稀释包涵体下降,下降2秒之间每下降。当注射完成后,在低速搅拌。
- 隔夜继续低速搅拌,在4 ° C。
浓度的复性反应
- Millipore公司S协议,集中1升的预过滤(0.22μm的过滤),复性反应使用Amicon搅拌细胞和YM10 NMWL 10K超滤膜(Millipore公司)〜10毫升。
- 集中≤2毫升,使用一个Centriplus YM - 10 10K截留分子量(Millipore公司)。
KLRG1四聚体的纯化
- 安装在4 ° C,符合GE医疗手册的AKTAFPLC。
- 使用Sephacryl S - 200 16/60高分辨率柱(通用电气医疗集团)在20毫米的HEPES和150 mM氯化钠尺寸排阻色谱纯化单体形式存在的KLRG1。 (见图1)。
- 浓缩至1 ml,使用Centriplus YM - 10 10K截留分子量(Millipore公司)。
- 根据以亲和力S协议,使用比拉酶biotinylate KLRG1单体。
- 免费素是体积排阻色谱2淘汰。
- KLRG1分子tetramerized KLRG1单体与4倍超额摩尔聚乙烯共轭链霉亲和素(BD Biosciences公司)混合。
代表性的成果
AKTA FPLC尺寸排阻色谱图1。代表从积极的成果复性KLRG1。图表显示分离(83.52毫升)的单体,二聚体(56.36毫升),和multimer(36.26毫升)的复性KLRG1形式。 94.25毫升峰代表缓冲区交换。
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Discussion
在这个协议中,它是如何净化,biotinylate,tetramerize KLRG1。 KLRG1四聚体可以用来标记流式细胞仪KLRG1配体。虽然复性条件进行测试,每个蛋白质的经验,其他的C型凝集素可tetramerized使用了类似的协议。使用tetramerized蛋白作为探针,对孤儿的C型凝集素受体的配体可能被确定。
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Acknowledgments
我们感谢博士Naidenko优化复性条件的帮助。这项工作是支持由美国国立卫生研究院的研究经费AI58181洛朗Brossay。辛迪迪班是由美国国立卫生研究院NRSA F31 AI080230支持。
斯蒂芬妮Terrizzi和辛迪迪班平等作出贡献,对这项工作。
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche Group | 11 836 170 001 | or equivalent |
Amicon Stirred Cell | Equipment | EMD Millipore | Model #8400 | or equivalent |
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | EMD Millipore | 13642 | |
15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | EMD Millipore | 4411 | |
AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
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