Summary
इस तकनीक के लिए उच्च संकल्प जादू कोण कताई प्रोटोन एमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (HRMAS 1h के मिसेज) का उपयोग सक्षम बनाता है जीना के आणविक लक्षण वर्णन
Abstract
उच्च संकल्प जादू कोण स्पिनिंग (HRMAS) प्रोटॉन चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (
Protocol
भाग 1: ड्रोसोफिला HRMAS माप के लिए तैयारी
- मानक flylab 1 प्रक्रियाओं का प्रयोग, नव 3 दिनों के लिए इकट्ठा मक्खियों eclosing और उन्हें हस्तांतरण ताजा मक्खी भोजन युक्त शीशियों मक्खी. 5 दिनों के लिए एकत्र मक्खियों तो सेते हैं कि मक्खियों 5-8 दिन पुरानी सिर्फ प्रयोग करने के लिए पहले हो जाएगा. केवल एक सेक्स (आमतौर पर पुरुषों) प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है.
- स्वस्थ का प्रयोग करें, बरकरार जंगली प्रकार के इलाज जैसे आघात या आनुवंशिक बदल मक्खियों 1 के साथ तुलना करने के लिए मक्खियों.
- 2ml मक्खी खाना 24 घंटे का एक टुकड़ा (0.2ml ~) के प्रयोग करने के लिए पहले से युक्त ट्यूबों में एकल मक्खियों रखें. इन ट्यूबों ट्यूब कप में एक छेद एक लौ गर्म इंसुलिन सुई का उपयोग किया सहन.
- ट्यूब तुरंत पहले और बाद में एक उच्च परिशुद्धता संतुलन का उपयोग कर उड़ सम्मिलन और वजन के बाद से पहली मूल्य subtracting द्वारा प्रत्येक मक्खी वजन को परिभाषित. एक एकल पुरुष मक्खी आमतौर पर 0.7-1 मिलीग्राम वजन का होता है.
भाग 2: HRMAS रोटर तैयार.
- बर्फ पर एक मक्खी अंदर anesthetize मिनट से भी कम समय के लिए एक एकल ट्यूब रखें.
- बर्फ पर रखा एल्यूमीनियम पन्नी की एक परत पर मक्खी लेटाओ और मक्खी एनएमआर रोटर एक नरम ब्रश का उपयोग कर डालने के लिए पूरा मक्खी सम्मिलन सुनिश्चित करते हुए उड़ चोट से बचने के semispherical खोखले अंतरिक्ष में धीरे से धक्का.
- Zirconium ऑक्साइड (2 ZrO) रोटर ट्यूब (4 मिमी व्यास, 50 μl) में डालने के प्लेस रोटर डालने और रोटर के नीचे (figure1 देखें) के बीच मक्खियों का पता लगाने के लिए.
- एक पेंच के साथ डालने बंद करो और यह parafilm (figure1 देखें) के साथ कवर मक्खी और टीएसपी मानक समाधान (टीएसपी के बीच संपर्क को रोकने: trimethylsilyl-propionic दो ,2,3,3 d4 एसिड, = 172 मेगावाट, δ = 0.00 पीपीएम deuterated पानी - डी 2 हे, दोनों अनुनाद रासायनिक पारी और मात्रा का ठहराव के लिए एक संदर्भ के रूप में है कि समारोह) में 50 मिमी .
- टीएसपी रोटर डालने के शीर्ष पर मानक समाधान के 8 μl जोड़ें. (1 आंकड़ा देखें).
- सुरक्षित और एक शीर्ष टोपी के साथ रोटार में स्थापित पूरे कस (1 आंकड़ा देखें).
भाग 3: HRMAS डाटा अधिग्रहण
- HRMAS जांच में रोटर परिचय और यह जादू कोण 54.7 ° (1 आंकड़ा देखें) पर स्थिति.
- MAS वायवीय इकाई के साथ संयोजन में एक BTO 2000 इकाई द्वारा 4 ° C में तापमान सेट. मक्खियों 4 ° सी, जबकि स्पेक्ट्रोमीटर के लिए संज्ञाहरण बनाए रखने में रखा जाता है.
- 2 kHz मास में HRMAS एच 1 मिसेज कताई की दर निर्धारित करें.
- 2.0 ± 0.001 kHz पर एक मास गति नियंत्रक (रोटेशन आवृत्ति) द्वारा MAS रोटेशन आवृत्ति स्थिर.
- चुंबक तैयारी के लिए: धुन और अनुकूलतम प्रदर्शन और स्पेक्ट्रा के इष्टतम गुणवत्ता के लिए चुंबक शिम के लिए तार मैच.
- [- (Τ-180 ° - τ) n - अधिग्रहण 90 °], जो एक टी 2 फिल्टर के रूप में काम करता है एक आयामी 1 एच (CPMG) स्पिन गूंज पल्स अनुक्रम 2, Carr - Purcell - Meiboom - गिल सिंक्रनाइज़ रोटर का उपयोग स्पेक्ट्रा मोल वर्णक्रमीय व्यापक बनाने 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा एकल मक्खी हटाने के लिए सभी नमूनों पर एक आयामी डेटा का अधिग्रहण . MAS रोटेशन आवृत्ति (2 kHz) अंतर पल्स देरी (τ = 500μs) सिंक्रनाइज़ करें. यात्रियों की संख्या 32,768 (32k) डेटा बिंदुओं के साथ 256 पर सेट करें. अधिग्रहण समय 9 मिनट.
- दो आयामी (2d) 1 एच 1 एच सभी adiabatic दालों के साथ 3 TOBSY अनुक्रम का उपयोग नमूनों पर HRMAS एनएमआर स्पेक्ट्रा एकल मक्खी मोल . अधिग्रहण मापदंडों हैं: 2k डेटा बिंदुओं प्रत्यक्ष आयाम (11 पीपीएम वर्णक्रमीय चौड़ाई), एस 1 विश्राम देरी के दौरान पानी पूर्व संतृप्ति, वेतन वृद्धि प्रति 8 स्कैन, 128 वेतन वृद्धि, 2 कुल पुनरावृत्ति समय, 45 एमएस मिश्रण समय, और कुल अधिग्रहण 29 मिनट के समय.
भाग 4: डाटा प्रोसेसिंग / विश्लेषण
- नमूनों की MRspectra MestReC सॉफ्टवेयर (Mestrelab अनुसंधान, www.mestrec.com) का उपयोग का विश्लेषण
- एक लाइन व्यापक बनाने 0.5 हर्ट्ज की apodization समारोह का प्रयोग करें और सभी HRMAS एच 1 FIDS फूरियर परिवर्तन करने से पहले से लागू है.
- सम्मान के साथ एमआर स्पेक्ट्रा संदर्भ δ = 0.0 पीपीएम (बाह्य मानक) पर टीएसपी.
- स्पेक्ट्रा मैन्युअल चरण और एक Whittaker आधारभूत अनुमानक लागू करने के लिए आधारभूत की व्यापक घटकों पीक क्षेत्र की गणना करने से पहले घटाना.
- चोटी क्षेत्रों MestReC सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अनुमान. प्रत्येक अधिग्रहीत स्पेक्ट्रम (टीएसपी चोटी ऊंचाई = 1) के लिए सम्मान के साथ स्केल शिखर ऊंचाइयों टीएसपी. के बीच समूहों के अनुपात के भीतर समूह की तुलना टी परीक्षण (दो पूंछ, पी <0.05) का उपयोग करें.
- QSINE = 2 दोनों आयामों में खिड़की समारोह, प्रत्यक्ष आयाम और दूसरा आयाम है, दूसरे आयाम में दोनों आयामों और आधारभूत सुधार चरण में सुधार में 1K के लिए शून्य भरने में 2k अंक के साथ एफटी: 2D TOBSY प्रक्रिया पैरामीटर हैं.
- 2D स्पेक्ट्रा का उपयोग कर कार्यक्रम Sparky (टीडी गोडार्ड और महानिदेशक Kneller, 3 Sparky USCF, निर्माण http://www.cgl.ucsf.edu/घर / / Sparky)
भाग 5: लाइव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर से प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा मक्खियों
ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं जीना ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खियों से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्पेक्ट्रा एकत्र की अनुमति . 2 आंकड़े और 3 शो प्रतिनिधि एमआर स्पेक्ट्रा जंगली प्रकार ओरेगन (wt) आर में अधिग्रहीत मक्खियों. चित्रा 2 1D एच 1 HRMAS CPMG स्पेक्ट्रा प्रस्तुत. प्रधान लिपिड घटकों [3 सी एच (0.89 पीपीएम), (2 सी एच) n (1.33 पीपीएम), सी 2 सी सीओ (1.58ppm) एच, सी एच 2 सी = (2.02 पीपीएम) सी, सी 2 एच सी = O (2.24 पीपीएम), सी एच = सी एच (5.33 पीपीएम), (1,3 सी एच 4.10 पीपीएम और 4.30 पीपीएम, 2 CH-2 5.24 पीपीएम) ग्लिसरॉल, और छोटे चयापचयों: β-Alanine (β-आला , 2.57) पीपीएम, एसीटेट (एसी, 1.97 पीपीएम), (पीसी, 3.22 पीपीएम) phosphocholine और phophoetanolamine (पीई, 3.23ppm) का पता चला रहे थे और पूर्व रिपोर्ट 4, 5 के अनुसार सौंपा. 2.02 पीपीएम पर सिग्नल सी H2 CH-CH = मोनो असंतृप्त वसा अम्ल (यानी palmitoleic) का आधा भाग के methylene प्रोटॉन को सौंपा गया. असंतृप्त एसिड 5.33 पीपीएम CH-= सीएच - आधा भाग के प्रोटॉन द्वारा उत्पादन में एक संकेत द्वारा की पहचान की गई. लघु चयापचयों कि या नहीं सौंपा दिखाई 1D स्पेक्ट्रम का उपयोग नहीं थे 2D 1 एच 1 एच का उपयोग पाया गया TOBSY HRMAS (आंकड़ा 3 देखें).
चित्रा 1 प्रायोगिक vivo में सेट. HRMAS 1h के मिसेज deuterated पानी में 14.1 टी. विदेश trimethylsilyl-propionic-2 मानक एसिड ,2,3,3 d4 (टीएसपी / 2 डी एंड ओ) में रहते हैं ड्रोसोफिला की जांच के लिए . HRMAS जांच में जादू कोण पर रोटर स्थिति: वर्ग में.
एक जीवित ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर wt मक्खी के vivo में 1D HRMAS 1 एच CPMG स्पेक्ट्रा में चित्रा 2. लिपिड घटक: सी 3 (0.89 पीपीएम), एच (2 सी एच) n (1.33 पीपीएम), सी 2 एच सी (1.58ppm) सीओ, एसीटेट (एसी), सी एच 2 सी = (2.02 पीपीएम) सी, सी एच 2 ग्लिसरॉल सी = (2.24 पीपीएम) हे, β Alanine (β-आला), (पीसी) phosphocholine और phophoetanolamine (पीई), (1,3 सी एच 4.10, 4.30 पीपीएम, एच 2 सी 2 5.22 पीपीएम) सी एच = सी एच (5.33 पीपीएम).
3 vivo 1h के 1h के 2D में चित्रा. TOBSY 14.1 टी. लघु चयापचयों और लिपिड घटकों पर एक जीवित ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर wt मक्खी की HRMAS स्पेक्ट्रम की पहचान की गई. चयापचयों: (आला) alanine, β-Alanine (β-आला), arginine (Arg), glutamine (GLN), ग्लूटामेट (Glu), पीसी phosphocholine (पीसी), phophoetanolamine (पीई), Taurine (ताउ), α ग्लुकोज (α-GLC) और ग्लिसरॉल. Lipids घटकों: 3 सी एच (0.89 पीपीएम), (2 सी एच) n (1.33 पीपीएम), सी एच 2 सी सीओ (1.58 पीपीएम), सी एच 2 सी = (2.02 पीपीएम) सी, सी एच 2 सी = हे (2.24 पीपीएम), सी एच = सी एच (5.33 पीपीएम).
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Discussion
फल में vivo एमआरआई में की व्यवहार्यता की ताजा रिपोर्ट के अपवाद के साथ 6 मक्खियों, ड्रोसोफिला में vivo मिसेज अध्ययन में अभी तक रिपोर्ट नहीं किया गया है . वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम biologically महत्वपूर्ण अणुओं का पता लगाने के लिए vivo HRMAS 1 एच मिसेज दृष्टिकोण में एक उपन्यास के कार्यान्वयन का वर्णन. विशेष रूप से, हम lipids और रहते हैं ड्रोसोफिला में छोटे चयापचयों लगभग 45 मिनट है, जो पर्याप्त अधिग्रहण समय की अनुमति देता में 14.1 टी पर मक्खियों का पता चला, जबकि शून्य मक्खी मृत्यु दर को प्राप्त करने. एक रोटर सिंक्रनाइज़ WURST TOBSY में 8 adiabatic पल्स (1 15 C9) का उपयोग करने के लिए हमें की अनुमति दी एक संतोषजनक SNR और ऊतक के एक isotropic मिश्रण नाड़ी (MLEV 16) का उपयोग रिश्तेदार स्पेक्ट्रा के अच्छे संकल्प को प्राप्त पिछले के साथ समझौते में, 3 रिपोर्टों, 7. हमारे TOBSY का उपयोग करने के लिए ड्रोसोफिला के एक बेहतर चयापचय प्रोफ़ाइल का पता लगाने की क्षमता का पता चलता है TOBSY 1D CPMG के साथ इस्तेमाल किया है कि अच्छी तरह से एक साथ और metabolite सांद्रता के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और ड्रोसोफिला में मूल्यांकन चयापचय रोग के सुधार के लिए सक्षम बनाता है.
हमारे दृष्टिकोण बायोमार्कर के लिए जैव चिकित्सा मानदंड की जांच, जबकि vivo में गैर विनाशकारी ड्रोसोफिला में अनुसंधान दृष्टिकोण में उपन्यास के विकास को आगे बढ़ाने, और इस प्रकार उपन्यास चिकित्सात्मक विकास प्रत्यक्ष कर सकते हैं प्रदान करता है.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोगों मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल संस्थागत पशु अनुसंधान की समीक्षा बोर्ड समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस काम के हिस्से में एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य (NIH) के अनुदान AI063433 के लारेंस जी Rahme संस्थानों, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान संस्थान (एनआईएच) रोनाल्ड जी Tompkins (ए Aria Tzika, के निदेशक के लिए केंद्र अनुदान (P50GM021700) द्वारा समर्थित किया गया एनएमआर) कोर, और एक Shriner अस्पताल ए Aria Tzika बच्चों अनुसंधान अनुदान (# 8893) के लिए. हम Dionyssios Mintzopoulos पीएच.डी. धन्यवाद इस प्रोटोकॉल और Ovidiu सी. Andronesi पीएच.डी. के विकास के प्रारंभिक चरणों में सहायता के लिए TOBSY पल्स अनुक्रम के साथ सहायता के लिए.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
