Summary
טכניקה זו מאפשרת את השימוש זווית ברזולוציה גבוהה קסם ספינינג פרוטון MR ספקטרוסקופיה (HRMAS 1H-MRS) לאפיון מולקולרי של חיים
Abstract
ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג (HRMAS) פרוטון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית (
Protocol
חלק 1: תסיסנית הכנה מדידות HRMAS
- באמצעות תקן flylab נהלים 1, לאסוף החדש eclosing זבובים במשך 3 ימים ולהעביר אותם לטוס צלוחיות המכילות מזון לעוף טרי. דגירה הזבובים שנאספו במשך 5 ימים, כך הזבובים יהיה 5-8 ימים רק לפני הניסוי. רק מין אחד (בדרך כלל גברים) משמש עבור ניסויים.
- השתמש בריאים, סוג בר שלם זבובים להשוות עם טיפול בטראומה למשל או שינו גנטית זבובים 1.
- המקום זבובים בודד לתוך צינורות 2ml המכילה פיסה (~ 0.2ml) של מזון לטוס 24 שעות לפני הניסוי. צינורות אלה לשאת חור כוס הצינור עשוי באמצעות מחט להבה מחומם אינסולין.
- לשקול את הצינורות מיד לפני ואחרי הכניסה את הזבוב באמצעות איזון דיוק גבוהה להגדיר משקל של כל זבוב ידי הפחתת הערך הראשון של הלה. זבוב זכר יחיד שוקל בדרך כלל 0.7-1 מ"ג.
חלק 2: הכנת HRMAS רוטור.
- המקום צינור יחיד על קרח פחות מדקה להרדים בתוך לעוף.
- הנח את זבוב על שכבה של נייר אלומיניום דגש על קרח לדחוף בעדינות לטוס לחלל חלול semispherical של להכניס את הרוטור NMR בעזרת מברשת רכה כדי להבטיח חיבור לעוף שלם, תוך הימנעות מפגיעה לעוף.
- מניחים את להכניס תחמוצת זירקוניום (ZrO 2) צינור הרוטור (4 מ"מ קוטר, 50 μl) כדי לאתר את הזבובים בין להכניס את הרוטור התחתון של הרוטור (ראה figure1).
- סגור את הכנס עם בורג ולכסות אותו עם parafilm (ראה figure1) כדי למנוע את המגע בין זבוב לבין פתרון סטנדרטי כפית (כפית: trimethylsilyl-propionic-2-D4 ,2,3,3 חומצה, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 מ"מ deuterated מים-D 2 O, כי הפונקציה כהתייחסות למשמרת הן תהודה כימיים וכימות).
- הוסף 8 μl של פתרון כפית רגילה על גבי להכניס את הרוטור. (ראה תרשים 1).
- Secure והדק את כל להגדיר את הרוטורים עם כובע העליון (ראה תרשים 1).
חלק 3: HRMAS Data Acquisition
- הציגו את הרוטור לתוך החללית HRMAS ומקם אותה בזווית הקסם 54.7 ° (ראה איור 1).
- קביעת הטמפרטורה 4 מעלות צלזיוס על ידי יחידת BTO-2000 בשילוב עם יחידת MAS פנאומטי. זבובים נשמרים בעוד 4 מעלות צלזיוס בתוך הספקטרומטר לשמור על הרדמה.
- הגדר את H 1 HRMAS שיעור ספינינג גברת ב 2 MAS קילוהרץ.
- לייצב את התדר MAS סיבוב ב 2.0 ± 0.001 kHz על ידי בקר MAS מהירות (תדירות סיבוב).
- עבור הכנת מגנט: המנגינה ולהתאים את סליל עבור ביצועים אופטימליים פחית מגנט באיכות אופטימלית של הספקטרום.
- לרכוש את אחת ספקטרה ממדי 1 H באמצעות הרוטור מסונכרן קאר, פרסל, Meiboom-גיל (CPMG) ספין הד הדופק רצף 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-רכישה], אשר פועל כמסנן T 2 ל להסיר את הרחבת הספקטרום 1 H NMR יחיד לטוס ספקטרה כדי רכשה חד ממדי נתונים על כל הדגימות. סנכרן את העיכוב בין דופק (τ = 500μs) לתדר MAS את הסיבוב (2 קילוהרץ). הגדר את מספר הארעיים ב 256 עם 32,768 (32K) נקודות נתונים. זמן רכישת 9 דקות.
- רוכשת דו ממדי (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR יחיד לטוס ספקטרום על כל הדגימות באמצעות רצף TOBSY עם פולסים adiabatic 3. הפרמטרים רכישת הם: 2k נקודות נתונים מימד ישיר (11 עמודים לדקה רוחב הספקטרום), 1 של מים מראש הרוויה במהלך העיכוב הרפיה, 8 סריקות לכל תוספת, במרווחים של 128, זמן החזרה סך של 2, 45 ms זמן ערבוב, רכישה בסך הכל זמן של 29 דקות.
חלק 4: עיבוד נתונים / ניתוח
- ניתוח של דגימות MRspectra MestReC באמצעות תוכנה (Mestrelab המחקר, www.mestrec.com)
- השתמש קו הרחבה פונקציה apodization של הרץ 0.5 וחלים על כל 1 FIDs HRMAS H לפני השינוי פורייה.
- הפניה ספקטרה MR ביחס כפית עמודים לדקה δ = 0.0 (תקן חיצוני).
- שלב ספקטרום ידני ולהחיל אומד הבסיס וויטאקר תפחית את הרכיבים רחב של הבסיס לפני החישובים אזור השיא.
- אומדן שטחים שיא באמצעות תוכנת MestReC. סולם גבהים שיא ביחס כפית עבור כל קשת רכשה (כפית גובה שיא = 1). השתמש t-בדיקות (שני זנב, p <0.05), להשוות בתוך הקבוצה בין קבוצות יחסים.
- 2D פרמטרים TOBSY התהליך הם: QSINE = 2 פונקציה חלון בשני המימדים, FT עם נקודות 2k בממד ישיר אפס מילוי כדי 1k בממד השני, תיקון פאזה בשני הממדים תיקון הבסיס בממד השני.
- לייצר את ספקטרום 2D באמצעות ספרקי התוכנית (TD גודארד ו DG Kneller, ספרקי 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/בית / ספרקי /)
חלק 5: ספקטרה נציגת חיים תסיסנית melanogaster זבובים
הנהלים שתוארו לעיל היתר לאסוף ספקטרה לשחזור מתוך לחיות זבובי תסיסנית melanogaster. איורים 2 ו -3 מראים נציג MR ספקטרה שנרכש wild-type (wt) אורגון-R זבובים. תרשים 2 מציג 1D 1 H ספקטרה HRMAS CPMG. השומנים המרכיבים העיקריים [ג H 3 (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm)], גליצרול (1,3 C-H ו - 4.10 ppm 4.30 עמודים לדקה; 2-CH 2 5.24 ppm), ומטבוליטים קטנה: β-אלאנין (β-עלא , 2.57 ppm), אצטט (AC, 1.97 ppm), phosphocholine (PC, 3.22 לדקה) ו phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) התגלו והוצב על פי הדיווחים לפני 4, 5. איתותי עמודים לדקה 2.02 חולקו פרוטונים מתילן של מחצית H2-CH = CH-C של מונו חומצות שומן בלתי רוויות (כלומר palmitoleic). חומצות בלתי רוויות זוהו על ידי אות עמודים לדקה 5.33 המיוצר על ידי פרוטונים של מחצית-CH-CH =. מטבוליטים קטנים שלא ניתן היה מוקצה, או שלא נראו באמצעות ספקטרום 1D התגלו באמצעות 2D 1 H-1 H TOBSY HRMAS (ראה איור 3).
באיור 1. ניסיוני להגדיר של in vivo HRMAS 1H גברת לחקירת לחיות תסיסנית על חומצה 14.1 ,2,3,3-D4 ט חיצוני סטנדרטי trimethylsilyl-propionic-2 במים deuterated (כפית / D 2 O). בכיכר: מיקום הרוטור בזווית קסם HRMAS בדיקה.
איור 2. Vivo ב 1D HRMAS ספקטרה 1 CPMG H של זבוב חי תסיסנית wt melanogaster. שומנים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), אצטט (AC), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), β-אלאנין (β-עלא), phosphocholine (PC) ו phophoetanolamine (PE), גליצרול (1,3 C-H 4.10, 4.30 עמודים לדקה; 2-C H 2 5.22 ppm) , C = C H H (5.33 ppm).
איור 3. Vivo 2D 1H-1H TOBSY ספקטרום HRMAS של זבוב תסיסנית לחיות wt melanogaster ב 14.1 מטבוליטים ט קטנים ורכיבים השומנים זוהו. מטבוליטים: אלאנין (עלא), β-אלאנין (β-עלא), ארגינין (Arg), גלוטמין (Gln), גלוטמט (Glu), phosphocholine מחשב (PC), phophoetanolamine (PE), טאורין (טאו), α-גלוקוז (α-Glc) ו גליצרול. ליפידים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58 ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למעט הדוח האחרון של היתכנות של MRI in vivo בפרי זבובים 6, in vivo גברת לימודי תסיסנית טרם דיווחו. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את יישום רומן בגישה vivo HRMAS H-1 גברת לאיתור מולקולות חשובות מבחינה ביולוגית. במפורש, זיהינו שומנים מטבוליטים קטנים לחיות תסיסנית זבובים ב 14.1-T ב כ 45 דקות, המאפשר רכישת זמן הולם, תוך השגת התמותה לטוס אפס. השימוש רוטור-מסונכרן נקניקיות-8 adiabatic הדופק (C9 1 15) ב TOBSY מותר לנו לקבל SNR משביע רצון והחלטה טובה של ספקטרום רקמות ביחס לשימוש הדופק ערבוב איזוטרופיים (MLEV-16), בהסכם עם הקודם דוחות 3, 7. היכולת שלנו להשתמש TOBSY לזהות פרופיל מטבולי משופר של תסיסנית עולה כי השתמשו TOBSY עם CPMG 1D הוא גם מתאים איכותיים סימולטני ניתוח כמותי של ריכוז המטבוליט ומאפשר הערכה משופרת של תפקוד חילוף החומרים תסיסנית.
הגישה שלנו מציעה סמנים לחקור פרדיגמות ביו תוך קידום הפיתוח של רומן הרסני vivo גישות מחקר תסיסנית, ולכן רשאי להורות התפתחות טיפולית חדשנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית החולים הכללי מסצ'וסטס ועדת המחקר מוסדיים בעלי חיים הדירקטוריון סקירה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) כדי להעניק AI063433 לורנס ג רחמה, מכון המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מרכז גרנט (P50GM021700) כדי רונלד ג טומפקינס (א 'אריה ציקה, מנהל הליבה NMR), ובית החולים של שריינרים לילדים מענק מחקר (# 8893) א 'אריה ציקה. אנו מודים Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. סיוע בשלבים הראשונים של פיתוח זה פרוטוקול Ovidiu ג Andronesi Ph.D. לקבלת סיוע עם רצף הדופק TOBSY.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
