Summary
Denna teknik möjliggör användandet av högupplösta magiska vinkel spinning proton MR spektroskopi (HRMAS 1H-MRS) för molekylär karakterisering av levande
Abstract
Högupplösta Magic-Angle Spinning (HRMAS) protoner magnetisk resonans spektroskopi (
Protocol
Del 1: Förbereda Drosophila för HRMAS Mått
- Med standard flylab förfaranden 1, samla nya eclosing flugor i 3 dagar och överföra dem att flyga injektionsflaskor med färska flyga mat. Inkubera samlas flugor i 5 dagar så att flugorna kommer att bli 5-8 dagar gammal strax före experimentet. Endast det ena könet (oftast män) används för experiment.
- Använd sunt, flugor intakt vildtyp att jämföra med behandlade t.ex. traumatiserade eller genetiskt förändrade flugor 1.
- Placera enda flyger in 2 ml provrör innehållande en bit (~ 0,2 ml) av den 24 flyger mat timmar före experimentet. Dessa rör bära ett hål i röret koppen görs med en låga uppvärmd insulin nål.
- Väg rören omedelbart före och efter flugan insättning med en hög precision balans och definiera varje flyga s vikt genom att subtrahera det första värdet från den senare. En enda manlig fluga väger vanligtvis 0,7-1 mg.
Del 2: HRMAS Rotor Förberedelser.
- Placera ett enda rör på is för mindre än en minut att söva flyga inuti.
- Lägg flyga på ett lager av aluminiumfolie placeras på is och tryck flyga försiktigt i semispherical ihåliga utrymmet i NMR rotorn in med en mjuk borste för att säkerställa fullständig flyga isättning och samtidigt undvika flyga skada.
- Sätt in den i zirkoniumoxid (ZrO 2) rotorröret (4 mm diameter, 50 l) för att lokalisera flugorna mellan rotorn in och botten av rotorn (se figur 1).
- Stäng in med en skruv och täck den med parafilm (se figur 1) för att förhindra kontakt mellan flyga och TSP standardlösning (TSP: trimetylsilylsilikat-propionsyra-2 ,2,3,3-D4 syra, MW = 172, δ = 0,00 ppm, 50 mm deuterated vatten-D 2 O, som fungerar som en referens för både resonans kemiska skift och kvantifiering).
- Tillsätt 8 l av TSP standardlösning ovanpå rotorn in. (Se figur 1).
- Säkra och dra åt hela uppsättningen upp i rotorer med en topplatta (se figur 1).
Del 3: HRMAS datainsamling
- Introducera rotorn in i HRMAS sonden och placera den på den magiska vinkeln 54,7 ° (se figur 1).
- Ställ in temperaturen vid 4 ° C genom ett BTO-2000 enhet i kombination med MAS pneumatiska enheten. Flugor hålls vid 4 ° C medan den i spektrometern att upprätthålla anestesi.
- Ställ HRMAS 1 H MRS spinning takt 2 kHz MAS.
- Stabilisera MAS rotationsfrekvensen på 2,0 ± 0,001 kHz genom en MAS varvtalsregulator (Rotation frekvens).
- För magnet preparatet: melodi och matcha spolen för optimal prestanda och shim magneten för optimal kvalitet av spektra.
- Förvärva endimensionella 1 H spektra med hjälp av rotorn synkroniserade Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin eko pulssekvens 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-förvärvet], som fungerar som ett T 2 filter ta bort den spektrala bredda 1 H NMR enda fluga spektra av förvärvade endimensionella uppgifter om alla prover. Synkronisera mellan puls fördröjning (τ = 500μs) till MAS rotationsfrekvensen (2 kHz). Ställ in antalet transienter på 256 med 32.768 (32k) datapunkter. Förvärv gången 9 min.
- Förvärva tvådimensionella (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR enda fluga spektra på alla prover med en TOBSY sekvens med adiabatisk pulser 3. Förvärv parametrar är: 2k datapunkter direkt dimension (11 ppm spektrala bredd), 1 s vatten pre-saturation under avslappning dröjsmål 8 scanningar per steg, 128 steg, 2 s totala upprepning tid, 45 ms blandning tid, och ett totalt förvärv tid 29 min.
Del 4: Data Processing / Analys
- Analysera MRspectra av prover med MestReC programvara (Mestrelab Forskning, www.mestrec.com)
- Använd en line-breddning Apodisering funktion av 0,5 Hz och gäller för alla HRMAS 1 H FIDs före Fourier transformation.
- Referens MR spektra med avseende på TSP på δ = 0,0 ppm (extern standard).
- Fas spektra manuellt och tillämpa en Whittaker baslinje estimatorn att subtrahera den breda delar av baslinjen innan topparea beräkningar.
- Uppskatta toppareorna med MestReC programvara. Skala topphöjder med avseende på TSP för varje förvärvad spektrum (TSP topphöjd = 1). Använd t-test (tvåsidigt, p <0,05) för att jämföra inom-gruppen till mellan-grupper nyckeltal.
- 2D TOBSY processparametrar är: QSINE = 2 fönster fungerar i båda dimensionerna, FT med 2k poäng i direkt dimension och noll-fyllning till 1k i den andra dimensionen, fas korrigering i både mått och baslinjekorrigering i den andra dimensionen.
- Producera 2D-spektra med hjälp av Sparky-programmet (TD Goddard och GD Kneller, Sparky 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/Hem / Sparky /)
Del 5: Representant Spectra från Live Drosophila melanogaster Flugor
De förfaranden som beskrivs ovan tillstånd att samla in reproducerbar spektra från levande Drosophila melanogaster flugor. Figurerna 2 och 3 visar representativa MR spektra förvärvades vildtyp (wt) Oregon-R flugor. Figur 2 visar 1D 1 H HRMAS CPMG spektra. Principal lipidkomponenten [C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (1,33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C H = C H (5,33 ppm)], glycerol (1,3-C H 4,10 ppm och 4,30 ppm, 2-CH 2 5,24 ppm), och små metaboliter: β-alanin (β-Ala var 2,57 ppm), acetat (Ac, 1,97 ppm), phosphocholine (PC, 3,22 ppm) och phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) identifieras och tilldelas i enlighet med tidigare rapporter 4, 5. Signaler på 2,02 ppm tilldelades metylen protoner av C H2-CH = CH fraktion av mono-omättade fettsyror (dvs. palmitoleic). Den omättade fettsyror har identifierats genom en signal vid 5,33 ppm produceras av protoner i-CH = CH-fraktionen. Små metaboliter som inte kunde överlåtas eller inte var synliga med hjälp av 1D spektrum upptäcktes med hjälp av 2D-1 H-1 H TOBSY HRMAS (se figur 3).
Figur 1. Experimentella inrättandet av in vivo HRMAS 1H MRS för undersökning av levande Drosophila på 14,1 T. extern standard trimetylsilylsilikat-propionsyra-2 ,2,3,3-D4 syra i deuterated vatten (TSP / D 2 O). På torget: rotorns position på den magiska vinkel i HRMAS sonden.
Figur 2. In vivo-1D HRMAS 1 H CPMG spektra av en levande Drosophila melanogaster wt flyga. Lipid komponenter: C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (1,33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), acetat (AC), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), β-alanin (β-Ala), phosphocholine (PC) och phophoetanolamine (PE), Glycerol (1,3-C H 4,10, 4,30 ppm, 2-C H 2 5,22 ppm) , C H = C H (5,33 ppm).
Figur 3. In vivo 2D 1H-1H TOBSY HRMAS spektrum av levande Drosophila melanogaster WT flyga på 14,1 T. Små metaboliter och komponenter lipid identifierades. Metaboliter: alanin (Ala), β-alanin (β-Ala), arginin (Arg), glutamin (GLN), glutamat (Glu), PC phosphocholine (PC), phophoetanolamine (PE), taurin (TAU), α-glukos (α-Glc) och glycerol. Lipider komponenter: C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (1,33 ppm), C H 2 C-CO (1,58 ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C H = C H (5,33 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med undantag av den senaste rapporten från möjligheten att in vivo MRT i bananflugor 6 har in vivo MRS studier i bananfluga ännu inte rapporterats. I det nuvarande protokollet beskriver vi genomförandet av en ny in vivo HRMAS 1 H-MRS metod för att upptäcka biologiskt viktiga molekyler. Vi upptäckte framförallt lipider och små metaboliter i levande Drosophila flyger på 14,1 T i ca 45 min, vilket ger tillräcklig förvärvet tid, och samtidigt uppnå noll flyga dödlighet. Användningen av en rotor-synkroniserad WURST-8 adiabatisk puls (C9 en 15) i TOBSY möjligt för oss att få en tillfredsställande SNR och bra upplösning av vävnad spektra i förhållande till användningen av ett isotropt blanda puls (MLEV-16), i samförstånd med tidigare rapporter 3, 7. Vår förmåga att använda TOBSY att upptäcka en förbättrad metabol profil Drosophila antyder att TOBSY används med 1D CPMG lämpar sig väl för samtidig kvalitativ och kvantitativ analys av koncentration av metaboliter och möjliggör bättre utvärdering av metabola dysfunktion i Drosophila.
Vår strategi ger biomarkörer för att undersöka biomedicinska paradigm samtidigt främja utvecklingen av nya in vivo oförstörande forskningsmetoder i Drosophila, och därmed får direkt nya terapeutiska utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Massachusetts General Hospital Institutional Animal Research Review Board kommittén.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av en National Institutes of Health (NIH) bevilja AI063433 till Laurence G. Rahme, en National Institute Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) till Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, chef för NMR kärna), och en Shriner sjukhus för barn forskningsanslag (# 8893) till A. Aria Tzika. Vi tackar Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. för att få hjälp i de inledande faserna för att utveckla detta protokoll och Ovidiu C. Andronesi Ph.D. för hjälp med TOBSY pulssekvens.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
