Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Summary

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Abstract

Um protocolo detalhado para cristalizar proteínas da membrana usando mesofases lipídica é descrita. Este método tem diversas sido referido como a fase lipídica cúbicos ou no método meso. O método tem se mostrado bastante versátil na medida em que tem sido utilizado para resolver de raios-X estruturas cristalográficas de proteínas procariotas e eucariotas, as proteínas que são monoméricas, homo e hetero-multimérica, contendo cromóforos e cromóforo-free, e alfa -hélice e proteínas beta-barril. Sucessos recentes usando em cristalização meso são os humanos engenharia beta2-adrenérgico e adenosina A2a G receptores acoplados à proteína. Protocolos são apresentados para reconstituir a proteína de membrana para a mesofase monoolein de base, e para a criação de cristalizações no modo manual. Etapas adicionais no processo global, como a colheita de cristal, estão a ser abordados em artigos de vídeo futuro. O tempo necessário para preparar a mesofase proteína-carregados e para configurar uma placa de cristalização manualmente é cerca de uma hora.

Protocol

Um foco importante na área de biologia estrutural e funcional é a membrana biológica (Figura 1). A membrana, que envolve a célula e sub-celular organelas quando presente, é uma estrutura molecular fina apenas duas moléculas lipídicas de diâmetro e está repleta de proteínas. Estrutura e função como aplicadas a ambos os lipídios e as proteínas são de interesse. No entanto, o foco deste artigo se restringe a proteínas da membrana.

Uma melhor compreensão de como as proteínas da membrana funcionam em um nível molecular é procurado por duas razões. Em primeiro lugar, há a satisfação intelectual em saber como eles funcionam. Em segundo lugar, por saber como funciona uma proteína, há sempre a perspectiva de ser capaz de corrigi-lo deveria mau funcionamento ou de melhorar ou mesmo modificá-lo para aplicações específicas. Desenho de drogas é um resultado óbvio deste tipo de trabalho. Uma abordagem a figurar como uma proteína de membrana funciona em um nível molecular é determinar a sua estrutura. Isso implica o estabelecimento do local em 3-dimensional do espaço de todos os átomos, ou pelo menos todos os átomos não hidrogênio, que compõem a proteína. O método que utilizamos para este fim é a cristalografia macromolecular de raios-X (MX). A Figura 2 mostra um exemplo de uma proteína de membrana cuja estrutura foi determinada usando MX. Um cristal de difração de qualidade da proteína é obrigado a fazê-MX.

Claramente, há muitas etapas envolvidas na determinação da estrutura usando cristalografia de macromoléculas. Isto é ilustrado na Figura 3. Normalmente, estas incluem a identificação de uma proteína de membrana-alvo, e depois produzir, purificar e cristalizar-lo. Medidas de difração são realizadas sobre o cristal com uma casa ou um síncrotron fonte de raios-X. Os dados de difração são processados ​​gerando um mapa de densidade de elétrons, que depois é equipado com um modelo molecular. O modelo, quando refinado, pode ser usado para explorar o mecanismo de ação da proteína e para a estrutura baseada em desenho de drogas.

O foco deste artigo é mostrar como se produz cristais de difração de qualidade de proteínas da membrana lipídica utilizando mesofases, pela chamada no método meso. Uma recente revisão do método e seu escopo está disponível na Referência 1 (Caffrey, 2009). O protocolo passo a passo vamos seguir aqui é descrito na referência 2 (Caffrey e Cherezov, 2009).

Um fluxograma resumindo as etapas envolvidas e tempo necessário para a criação de um julgamento no meso cristalização de proteínas da membrana é mostrado na Figura 4. Este artigo abrange os passos delimitada por linhas tracejadas vermelhas.

Parte 1: Preparação das Placas Cristalização

1. A posição de uma lâmina de microscópio silanizadas na bancada de trabalho.
2. Remova a tampa do papel de proteção de uma superfície de uma tira de fita dupla espaçador vara perfurado (comercialmente disponíveis, consulte a Tabela de Reagentes e equipamentos específicos abaixo).
3. Coloque a fita lado, pegajoso para baixo, em contato com a superfície da lâmina.
4. Pressão selo a fita para o slide usando um Brayer ou rolo. Folha de alumínio pode ser colocado entre a fita eo rolo de proteger a base dos poços.
5. Remova a tampa do papel segundo a partir da fita para expor a sua superfície superior pegajosa.
6. Lugar individual lamínulas silanizadas em estreita proximidade com a chapa para a selagem rápida e eficiente de poços, assim como a carga está completa.

Parte 2: Preparar a seringa Lipid

1. Coloque o lipídio (muitas vezes monoolein) em um bloco com temperatura controlada a 45 ° C por 3 minutos para torná-lo derretido.
2. Enquanto o lipídio está derretendo preparar dois 100-mL seringas à prova de gás para uso Hamilton na etapa de lipídios proteínas mistura. Remova a ponteira Teflon da seringa que irá conter a solução de proteína. Coloque a seringa que conterá o lipídio ao lado dele (deixando a sua ponteira no lugar).
3. Conecte o acoplador (ver Tabela de Reagentes e equipamentos específicos abaixo e Referência 3 (Cheng et al., 1998)) para a seringa de lipídios. Dedo a apertar o acoplador à seringa, mas não aperte demais. Remover o êmbolo do cilindro da seringa lipídico.
4. Note-se que o lipídeo deve ser derretido antes de prosseguir. Definir a pipeta a 30 mL e, lentamente, levar até cerca de 30 mL de lipídios fundido. Lentamente entregar o máximo de lipídios derretida como você pode na extremidade aberta da seringa tomando cuidado para não introduzir aberturas de ar.
5. Coloque o êmbolo para o barril em contato com o lipídio derretido e lentamente avançar o êmbolo até o barril com a seringa na posição vertical, como demonstrado no vídeo. Bolhas de ar que pode ser preso, inadvertidamente, deve subir no processo e ser liberado.
6. Determinar cuidadosamente o volume de lipídios na seringa lendo as marcas do corpo da seringa.
7. Deslize a ferrULE para a agulha que se estende do acoplador. Use o êmbolo para forçar o lipídio derretido até o barril e lenta e suavemente para dentro da agulha no centro do engate.

Parte 3: Preparando a Seringa Protein

1. A solução de proteína deve ser centrifugado a 14.000 g por 5 a 10 minutos a 4 ° C para remover grandes agregados antes da criação de ensaios de cristalização. Remover a solução de proteína a partir do gelo e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente.
2. Calcular o volume de solução de proteína a ser usada para formar a fase cúbica em ou perto de hidratação completa. Para monoolein a 20 ° C, a hidratação completa com água ocorre em cerca de 40% de água (em massa), como no diagrama de fase ⁵ (Figura 5).
3. Com uma seringa de Hamilton de 25 ou 50 mL levar até o volume necessário de solução de proteína. Transferir a solução na ponta de teflon do êmbolo no corpo da seringa proteína tomando cuidado para evitar bolhas de ar.
4. Cuidadosamente retire a agulha e medir o volume de solução de proteína na seringa. Ele deve corresponder ao valor entregue no passo anterior.
5. Lentamente, centímetro a solução de proteína até o barril para acabar lave com sua extremidade aberta.
6. Parafuso a seringa de proteína na extremidade aberta do acoplador anexado à seringa lipídico. É fundamental que o dispositivo não ser excessivamente apertada. O aperto excessivo o dispositivo montado mistura nesta fase irá danificar o virolas e causar vazamento. Sub-aperto também vai levar ao vazamento.

Parte 4: solução de proteína Mistura e Lipid: Fazendo a mesofase

1. Para efeito de mistura, o avanço do êmbolo do lado de proteína da unidade montada mistura ao seu limite, com o polegar ou dedo indicador condução da solução de proteína da seringa proteína, através do acoplador e com a seringa de lipídios.
2. O êmbolo do lado de lipídios é usado agora para dirigir o conteúdo da seringa de lipídios de volta através do acoplador e na seringa proteína.
3. O processo é repetido muitas vezes, ocasionalmente, uma centena de passagens ou mais são necessários para produzir uma mesofase homogênea. No início da mistura, o movimento de material e para trás através do acoplador pode ser desigual e, às vezes, força extra é necessária para efeito de mistura. Mistura inicial é geralmente acompanhada pelo desenvolvimento de uma nebulosidade não-uniforme na amostra. Como homogeneização progride, a textura torna-se mais uniforme e característicos da fase viscosa cúbicos, assim como o aspecto visual da mesofase emergentes cúbicos.
4. Se as condições forem apropriadas e as formas de fase cúbica, a dispersão deve aparecer opticamente transparentes na seringa. Assim, as marcas no corpo da seringa deve ser claramente legíveis através da mesofase no barril.
5. Resfriamento muito ligeiro da amostra durante a mistura, colocando o mixer seringa para um curto período de tempo no gelo pode acelerar a homogeneização ea obtenção de transparência. No entanto, é importante não arrefeça demasiado a amostra.
6. Cuidados devem ser tomados para evitar extremamente vigorosa mistura, pois isso pode causar a temperatura da amostra a subir devido ao aquecimento por fricção ^3.

Parte 5: Carregando a Dispenser

1. Remova a agulha e do êmbolo de uma seringa Hamilton de 10 mL. Deixe a ponteira de teflon no lugar.
2. Remova a porca de fixação do dispensador com a ajuda de uma pequena moeda.
3. Com o braço da catraca totalmente retirado, insira a seringa - sem o seu êmbolo e agulha - por meio do anel de realização do dispenser.
4. Substitua a porca de fixação, junta lado voltado para a seringa, e aperte-o firmemente no na extremidade aberta da seringa.
   Cuidados devem ser tomados para garantir a seringa está devidamente centrada no anel exploração e que o barril está alinhado paralelo ao braço da catraca. Ambos podem ser julgados por olho. Esses dois requisitos são fundamentais para evitar vazamentos.
5. Passe o êmbolo através do anel de aperto com a porca garra retirado algumas voltas e orientar o êmbolo na extremidade aberta da seringa. Deprimir o braço totalmente catraca. Mover o êmbolo para dentro do cilindro e verificar se ele viaja livremente e verdadeiro no barril. Ela pode ajudar a soltar o parafuso na barra de guia para facilitar o êmbolo se movendo livremente. Certifique-se que ele faz. O êmbolo até a sua ponta de teflon alinha com a marca de graduação de zero mL sobre o barril. Se o parafuso na barra de guia foi solto, reaperte-lo e verifique novamente o êmbolo que se move livremente.
6. Mover o êmbolo de um lado da unidade montada mistura à marca de graduação de zero mL para transferir a mesofase para a outra seringa e do acoplador.
7. Desconectar a seringa vazia (com sua ponteira no lugar) da unidade de mistura e imediatamente se conectar a seringa carregada - com o acoplador de umttached - com a rescisão threaded da seringa dispensar 10-mL. O grau de aperto com que o acoplamento é feito é crítica, como já assinalado.
8. Carregar a seringa dispensando pressionando o êmbolo da seringa de 100 mL, para que as transferências mesofase através do acoplador.
9. Segura uma pequena, agulha de ponta chata para a rescisão de aço da seringa distribuição e aperte cuidadosamente no lugar.
10. Prender o êmbolo para o braço da catraca, apertando a porca no anel de fixação. Cuidados devem ser tomados para não aperte demais a porca, pois isso pode marcar e deformar o êmbolo tornando-o inutilizável. É importante que o intervalo de viagem previsto para o braço da catraca na condição de preso ser limitado a não mais do que uma polegada, como demonstrado no vídeo. Além disso, o êmbolo vai ter uma tendência a fivela e entrega pode falhar.
11. Deprimir o tambor catraca várias vezes para avançar o êmbolo no barril, preenchendo assim o volume vazio da agulha e carregamento da agulha. Esta etapa deve ser repetida (até dez vezes) até que uma seqüência contínua da mesofase emerge a partir da ponta da agulha.
12. Ensaios de cristalização deve começar imediatamente, já que algumas proteínas são instáveis ​​na fase cúbica sem precipitante acrescentou.

Parte 6: Configurando Placas Cristalização

1. Colocar uma placa de cristalização multi-bem e lamínula sobre uma superfície levantou alguns centímetros acima da bancada de trabalho para facilitar o carregamento. Um óptimo contraste e visibilidade são alcançados quando a superfície é um pouco escuro.
2. Homogeneizar as soluções precipitante e uncap os frascos. Definir a distribuição de pipeta precipitante de 1 mL.
3. Com a seringa na posição vertical dispensar em uma mão, use a mão livre para posicionar a ponta da agulha no centro e diretamente acima da base do número bem 1. Pressione o botão no dispensador repetindo para expulsar um bolus de mesofase na superfície de vidro. O volume de bolus é de 200 nL quando o dispenser padrão de repetição é usada com uma seringa de 10 mL. A ponta da agulha deve ser não mais do que algumas centenas de micrômetros acima da base do poço para garantir a entrega adequada.
4. Depois de quatro poços adjacentes são carregados com mesofase, coloque 1 mL de solução precipitante em cima de cada bolus mesofase usando uma pipeta de 2 mL e as pontas descartáveis.
5. Tão rapidamente quanto possível, coloque uma lamela diretamente sobre os poços cheios para cobri-los de maneira uniforme. Para efeito de um selo à prova d'água, use uma espátula para aplicar pressão sobre a lamela onde faz contato com a superfície exposta da fita adesiva espaçador.
6. A mesofase e processo de distribuição precipitante pode ser repetido até que todos os poços na placa são carregados e lacrados.
7. Etiqueta da placa claramente para fins de controle. Proteínas sensíveis à luz são normalmente tratadas por envolvimento das placas em papel alumínio antes de colocá-los na câmara de incubação.
8. Coloque as placas em uma câmara com temperatura controlada, geralmente a 20 ° C.
9. Em uma programação regular, fiscalizar os poços para o crescimento de cristais usando um microscópio de luz polarizada com um objectivo de 10 ou 20 vezes. A programação utilizada no laboratório do autor é a seguinte: dia 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 e 60 pós-instalação. Inspecione cuidadosamente o bolo mesofase ajustar a profundidade do foco dentro da amostra 0,14 mm de espessura. Exame deve ser feito tanto na luz normal e cruzado entre polarizadores.

Parte 7: Resultados Representante

O aparecimento dos cristais resultantes variam de acordo com a cor inerente à proteína de membrana, a polarização da luz usada para a inspeção (ou falta dela) e do método e da qualidade de iluminação. A Figura 6 mostra várias aparições de cristal possível. Proteínas da membrana naturalmente colorido crescer em meso quando vistas com luz normal pode olhar como os mostrados na Figura 6 (b Painéis e d). Cristais incolores membrana proteína crescente na fase cúbicos quando vistas com luz normal pode olhar como os mostrados na Figura 6 (Painel e). Finalmente, os cristais de proteína de membrana incolor crescer em meso quando vistas com luz polarizada pode ser semelhante à Figura 6 (painéis A e C).

Os próximos passos no processo global de determinação de estrutura são a colheita e crio-cool dos cristais e para registrar e analisar difração de raios X a partir deles. Esses tópicos devem ser cobertos em artigos JOVE separado.

Figura 1. Representação esquemática de uma membrana biológica mostrando a bicamada lipídica e em que estão situados a uma variedade de proteínas.

Figura 2. A estruturada vitamina B transportar BtuB proteína _12,, resolveu usar MX e cristais crescidos pelo método ⁶ em meso ilustrado neste artigo Jove.

Figura 3. O ciclo estrutura-função ilustra muitas das etapas envolvidas na obtenção e utilização de informações estruturais completas sobre uma proteína.

Figura 4. O fluxograma resume as etapas envolvidas na produção de cristais de proteína de membrana pelo método em meso. Apenas os passos rodeada pela linha tracejada vermelha são abordados neste artigo Jove. De Referência 2.

Figura 5. Um diagrama de fases simplificado temperatura-composição para os lipídios (monoolein) / sistema de água. Ensaios de cristalização são criados a 20 ° C onde os lipídios saturados com água a hidratação de 40%. O diagrama de fases detalhadas estão disponíveis na referência 5.

Figura 6. Cristais de proteínas da membrana crescente na mesofase lipídica.
(A) de vitamina B ₁₂ proteína transportadora, BtuB ^6, (b) decolheita complexo II ^7, (c) a OPCA adesina / invasin ^8, (d) bacteriorodopsina ^9, (e) transportador um hidrato de carbono a partir de Pseudomonas. As imagens gravadas com a luz normal (b, d, e) e entre polarizadores cruzados (a, c).

Discussion

A fase cúbica é um ambiente delicado e dinâmico que pode mudar drasticamente com a alteração de um número de variáveis. Não é possível dar uma descrição da configuração do em ensaios de cristalização meso no modo manual que descreve todos os potenciais armadilhas. No entanto, muitas dificuldades podem ser evitadas através da prática da técnica antes de a aplicar soluções de proteína caro e usando moderação em pressão aplicada a seringas durante a mistura. Feito corretamente, o método em meso pode produzir cristais de uma grande variedade de proteínas, cujo número não pára de aumentar.

A descrição dada aqui da configuração de em ensaios de cristalização meso é focado no modo manual. O processo pode ser, e muitas vezes é modificado para facilitar a configuração automática das placas de cristalização nos casos que exigem grande escala de rastreio das condições de cristalização.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Protein solution	Reagent	Various	Various
Lipid (monoolein)	Reagent	Sigma-Aldrich	Various
Precipitant solutions	Reagent	Various	Various
Purified water	Reagent	EMD Millipore
Pipetting devices	Tool	Pipetman	Various
Disposable pipet tips	Disposable	Pipetman	Various
Gas-tight syringes	Tool	Hamilton Co	80265 (25-µl)
Syringe tips	Tool	Hamilton Co	7770-020 (gauge 22)
Narrow bore coupler*	Tool	Hamilton Co	various/EBS-LCP-2
Repeating dispenser	Tool	Hamilton Co	83700
Silanized glass microscope slides	Disposable	Gold Seal	3010
microscope coverslips	Disposable	Fisher Scientific	12-548C
Perforated double-stick spacer tape	Disposable	Saunders Corporation (hole-punched)	NA
Tweezers	Tool	Various	NA
Brayer (roller)	Tool	Fisher Scientific	50820937
Chipped ice	Temperature Control	N/A	NA
Tissues	Disposable	N/A	NA
Calculator	Tool	Various	NA
Lab notebook	Tool	Various	NA
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.