Препарирование органов у взрослых данио рерио

Summary

Этот протокол описывает процедуры выявления и рассекает органов у взрослых рыбок данио.

Abstract

За последние 20 лет, данио стал мощным организмом модель для понимания развития позвоночных и болезней. Хотя экспериментальный анализ эмбриона и личинки обширна и морфологии была хорошо документирована, описания взрослых данио анатомии и исследований развития взрослого структур и органов, а также приемы работы с взрослым не хватает. Органов личинки претерпевают значительные изменения в их общей структуре, морфологии и анатомического расположения во время личиночной для взрослых перехода. Внешне прозрачные личинки развивает свой характерный полосатый рисунок взрослых пигмента и парных плавников, в то время как внутри страны, органы подвергаются массивной роста и модернизации. Кроме того, bipotential зачаток гонады развивается в любом яичка или яичника. Этот протокол определяет многие из органов взрослых и демонстрирует методы вскрытия головного мозга, половые железы, желудочно-кишечного тракта, сердца и почек у взрослых рыбок данио. Расчлененные органы могут быть использованы для гибридизации на месте, иммуногистохимии, гистология, выделения РНК, белков анализа и других молекулярных методов. Этот протокол будет содействовать расширению исследований в данио включить реконструкцию личиночных органов, морфогенез органов, характерные для взрослого и других исследований взрослых систем организма.

Protocol

1. Мужской данио будет расчлененный первым, за ним женщина рыбы. Перед началом вскрытия, обезболить рыбы в 0,2% Tricaine а затем усыпить его инкубации в ледяной воде на 15 минут.
2. Начните слегка похлопывая рыба сушить на бумажное полотенце и размещение его на вскрытии мат. Внешне данио имеют одну спинной, хвостовой и анальный плавники и парные грудные и брюшные плавники (рис. 1).
   
   
   
   Рисунок 1. Взрослый самец рыба с плавниками маркированы.
   
3. Pin рыбы рассекает мат через мясистой части хвоста и вентральной части глазницы.
4. Snip кожи на брюхе рыбы только впереди анального плавника. Вырезать кожи и подлежащих мышцах вдоль живота от анального плавника до жаберной крышки (твердым покрытием более жаберные) (рис. 2, п. 1).
   
   
   
   Рисунок 2. Этапы удаления кожи и мышц стенки тела раскрыть внутренние органы.
   
5. Затем удалите жаберной крышки и грудных плавников, в том числе грудного пояса (толстые, костлявые область у основания плавника) (рис. 2, этап 2). Вырезать кожи и подлежащих мышцах начала сверху теперь подвергается жаберных сзади вдоль стороны рыбы, а затем вплоть до анального плавника (рис. 2, пункт 3).
6. Осторожно снимите кожи и подлежащих мышцах со стороны рыбы. Многие из внутренних органов теперь видны (рис. 3).
   
   
   
   Рисунок 3. Взрослый самец с стенкой тела и мышц позволяет удалить визуализации внутренних органов.
   
7. Яички длинные, белые, парных органов, которые прикреплены к спинной стенке тела. Удаление яичка и поместить его в блюдо PBS. Изучить яичка с отраженным светом для визуализации семенных канальцев (рис. 4), которые содержат кисты с различными стадиями развития половых клеток от spermatagonia к сперматиды (Лил и соавт., 2009).
   
   
   
   Рисунок 4. Препарирование яичка. Белый округлый структуры семенных канальцев.
   
8. Затем удалите из желудочно-кишечного тракта в полости тела рыбы. Печени можно определить по его большой размер, лопастные морфологии, tannish цвета, а также обширные васкуляризации. Желчного пузыря, зеленые полупрозрачные заполненный жидкостью мешок, и селезенки, которая появляется ярко-красная, находятся в пределах внутренних органов.
9. Отдельные кишечник от остальных органов и растянуть его. Передний, средних и задних отделах кишечника определяются высоты эпителиальных складок (Wallace и соавт., 2005).
10. Место кусок кишки в PBS и наблюдать эпителиальные складки использованием проходящем свете.
11. Далее, рассмотреть плавательного пузыря. Плавательный пузырь состоит из задней камеры, которая связана с пищеводом через пневматическую проток, и передняя камера, которая подключается к внутреннему уху через аппарат Вебера (Финни и соавт., 2006).
12. Удаляют плавательного пузыря. Изъять рыбы и повторно-контактный его брюшной стороне до рассекают почку, которая расположена вдоль спинной стенке тела. Почка полупрозрачной розовой структурой, связанной с спинной аорты и пигментных клеток. Почке делится на голову, тело и хвост регионов (рис. 5). Рассеките кусок из почек и поместить его в PBS. Tease, кроме почечной ткани выявить почечные канальцы.
    
    
    
    Рисунок 5. Расположение головы, тела и хвоста почку вдоль спинной стенке тела.
    
13. Рассеките самка рыбы. Как описано выше, усыпить рыбу в ледяной воде и насухо ему высохнуть, прежде чем закрепление его рассекает мат. Снимите кожу со стороны рыбы, как ранее продемонстрировано. Яичник двухлопастный структуру, которая висит в полости тела по васкуляризированной mesovarium.
14. Удаление одной доле яичников, поместите его в PBS, и рассмотреть его в проходящем свете. Ооциты могут быть дразнили друг от друга с использованием тонких игл, а затем поставил (рис. 6, Зельман и соавт., 1993). I этап ооциты примерно 10 - 150 мкм и прозрачным. Стадия II ооцитов около 150 - 350 мкм и определяется появление кортикальных гранул. Стадия III ооциты 350 - 750 мкм и непрозрачные из-за накопления желтка. Зрелой стадии IV и V ооциты полупрозрачные и вообще не найден в яичниках самок, которые в последнее время повязана.
    
    
    
    Рисунок 6. Живая стадии I, II, III и ооцитов наблюдалось прирассекает микроскопом в проходящем свете.
    
15. Далее рассекают сердце от рыбы. Сердце находится задний и нижний, чтобы жабры. Начните с вырезания сердца, и все окружающие ткани и размещение его в ФБР. Осторожно рассекают от ткани, окружающие сердце, будьте осторожны, чтобы не повредить тонкий атриум.
16. Место расчлененный сердце в раствор Рингера для наблюдения сердцебиения.
    Определить предсердие, желудочек и артериальный бульбуса (рис. 7, Ху Цзиньтао и соавт., 2001).
    
    
    
    Рисунок 7. Расчлененный взрослого сердца.
    
17. Полное вскрытие, удалив мозг от рыбы. Начните с открепления рыбы и удаления головы с лезвия бритвы. Удалите так много мягких тканей как можно дальше от брюшной стороне черепа щипцами. Удалить глаза с помощью небольших ножниц весной. Взламывай череп и удалить кости из брюшной стороне мозга. Теперь поместите голову в блюдо PBS и удалить кожу и кости черепа со спинной стороны головного мозга.
18. Определить обонятельных луковиц, конечного мозга, уздечка, оптические покрышки, мозжечка и продолговатого мозга (рис. 8, Wullimann и др., 1996;. Шиллинг, 2002).
    
    
    
    Рисунок 8. Расчлененный взрослом мозге рыбок данио. Спинной зрения, впереди сверху.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09