Summary
이 프로토콜은 성인 zebrafish에서 장기를 식별하고 해부를위한 절차를 설명합니다.
Abstract
지난 20 년 동안, zebrafish는 척추 개발과 질병을 이해하는 강력한 모델 생물되었다. 배아 및 유충의 실험 분석 광범위하며 형태가 잘 문서화되어 있지만, 함께 어른과 함께 작업을위한 기술과 성인 zebrafish의 해부학 및 성인 구조와 장기 발전 연구에 대한 설명이 부족합니다. 유충의 기관들은 전체적인 구조, 형태, 그리고 어른 전환하는 애벌레 동안 해부학 위치에 중대한 변화를 받고있다. 내부의 장기는 거대한 성장과 개조를 받아야하는 동안 외부, 투명 유충은 그 특성 성인 줄무늬 안료 패턴과 결합하여 골반 지느러미를 개발하고 있습니다. 또한, bipotential 생식선의 primordium은 testis이나 난소 중으로 개발하고 있습니다. 이 프로토콜은 성인의 기관의 많은 식별하고 두뇌, 생식선, 위장병 시스템, 심장, 그리고 성인 zebrafish의 신장의 해부하는 방법을 보여줍니다. 해부하는 기관은 현장 하이브리드화에 immunohistochemistry, 조직학, RNA 추출, 단백질 분석, 및 다른 분자 기법을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 애벌레 기관의 리모델링, 성인 장기 시스템의 성인 및 기타 조사 특정 장기의 morphogenesis을 포함 zebrafish의 연구 확대에 도움이 될 것입니다.
Protocol
- 남성 zebrafish는 여성 물고기 다음 먼저 해부하는 것입니다. 절개를 시작하기 전에 0.2 % Tricaine에서 물고기를 마취 후 15 분 동안 얼음물에 부화하여 안락사.
- 가볍게 종이 타월에 마른 생선을 끝날하고 해부 매트에 배치하여 시작합니다. 외부, zebrafish 단일 지느러미, 꼬리와 항문 지느러미와 결합하여 가슴과 골반 지느러미 (그림 1)가.
그림 1. 표시된 지느러미 달린 성인 남자 생선. - 꼬리의 다육 질의 부분을 통해 해부 매트에 생선과 안구 소켓의 복부 부분을 핀.
- 항문 지느러미에 단지 앞쪽에 물고기의 뱃속에있는 피부를 싹둑. 항문 지느러미에서 operculum에 배꼽을 따라 피부와 근육 기본 (아가미를 통해 하드 커버) (그림 2, 1 단계)을 잘라 버릴거야.
그림 2. 내장을 폭로하기 위해 피부 및 신체 벽면 근육을 제거하는 단계가. - 다음, 가슴 거들 (지느러미의 기지에서 두께, 뼈다귀 지역) (그림 2 단계 2)를 포함하여 operculum와 가슴 지느러미를 제거합니다. 아래 항문 지느러미 (그림 2, 3 단계)에 다음 생선의 측면을 따라 지금 노출된 길 뒤로 위쪽에서 피부와 근육 기본 시작 컷합니다.
- 조심스럽게 물고기의 측면에서 피부와 기본 근육을 제거하십시오. 내부 장기의 대부분은 (그림 3) 지금은 볼 수 있습니다.
그림 3. 신체 벽 근육과 성인 남성이 물고기는 내부 장기의 시각화를 허용 제거. - testes는 등의 신체 벽에 연결된 긴, 백색, 이점 기관입니다. testis를 제거하고 PBS 한 접시에 놓으십시오. spermatagonia에서 spermatids로 개발 배아 세포의 다양한 단계 (릴 외., 2009)와 cysts가 들어있는 정액을 운반하는 tubules (그림 4)를 시각화하는 반사광과 testis을 검사합니다.
그림 4. testis의 해부. 하얀 둥그스름한 구조는 정액을 운반하는 tubules 수 있습니다. - 다음 물고기의 뱃속에서 위장 시스템을 제거합니다. 간장은 그 큰 크기, lobed 형태, tannish 색상 및 광범위한 vascularization에서 확인할 수 있습니다. 밝은 빨간색으로 나타납니다 담낭, 녹색 반투명 액체 가득한 색, 그리고 비장은, 내장 내에 볼 수 있습니다.
- 장기의 나머지 부분에서 대장을 분리하고 그것을 스트레칭. 대장의 앞쪽에, 중간 및 사후 지역은 상피 주름의 높이 (월러스 외., 2005)에 의해 정의됩니다.
- PBS에서 소장의 조각을 장소와 전달 빛을 사용하여 상피 주름을 관찰.
- 다음, 수영 방광을 확인합니다. 수영 방광 Weberian 장치 (피니 외., 2006)을 통해 내이 (内耳)에 연결되어있는 공압 덕트, 그리고 앞쪽에 챔버를 통해 식도에 연결된 후부 챔버로 이루어져 있습니다.
- 제거하고 수영 방광을 삭제. 생선을 핀을 빼다 다시 핀 그 복부 쪽 최대 지느러미 몸 벽을 따라있는 신장을 해부하다 수 있습니다. 신장은 지느러미 대동맥과 색소 세포와 관련된 반투명 분홍색 구조입니다. 신장은 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역 (그림 5)으로 나뉘어져 있습니다. 신장의 한 부분을 절개하다하고 PBS에 놓으십시오. 신장 tubules을 나타내기 위해 신장 조직을 분리 애타게.
그림 5. 머리, 몸, 그리고 지느러미 몸 벽을 따라 꼬리 신장의 위치. - 여성 생선을 해부하다. 이전에 설명한 바와 같이, 얼음 물 속에 물고기를 안락사와 해부 매트에 걸어 건조하기 전에 그것을 두드려. 이전 증명과 같은 물고기의 측면에서 피부를 제거합니다. 난소는 vascularized mesovarium하여 뱃속에 정지하는 bilobed 구조입니다.
- 난소 중 하나 엽을 제거, PBS에 배치하고, 전송 빛을 그것을 검사합니다. oocytes는 좋은 바늘을 사용하여 분리 조롱하고 (그림 6, 셀맨 외., 1993) 개최하실 수 있습니다. 스테이지 I oocytes는 약 10 있습니다 - 크기와 반투명 150 미크론. 크기가 350 마이크론과 대뇌 피질의 과립의 모양에 의해 정의 - 스테이지 II의 oocytes는 약 150입니다. 스테이지 III의 oocytes는 350 있습니다 - 크기가 750 마이크론과 난황의 축적으로 인해 불투명하고 있습니다. 성숙 단계 IV 및 V oocytes는 반투명하고 일반적으로 최근에 짝짓기가 암컷의 난소에서 찾을 수 없습니다.
그림 6. 라이브 무대 I, II, III 및 제품 oocytes은 아래의 관찰전송 빛을 현미경을 해부. - 다음 물고기의 마음을 해부하다. 마음은 후부와 아가미에 복부에 위치하고 있습니다. 심장과 주변 조직의 모든을 절단하고 PBS에 배치하여 시작합니다. 조심스럽게 섬세한 아트리움을 손상하지 않도록주의하고, 심장을 둘러싼 조직을 멀리 해부하다.
- 심장 박동을 관찰하기 위해 링어의 솔루션으로 해부하는 마음을 놓으십시오.
아트리움, 뇌실 및 bulbus arteriosus (그림 7, 후진타오 외., 2001)를 식별합니다.
그림 7. 어른 마음을 해부 했어요. - 물고기의 머리를 제거하여 절개를 완료합니다. 물고기를 unpinning와 면도날로 머리를 제거하여 시작합니다. 포셉와 두개골의 복부 측면에서 가능한 한 많은 부드러운 조직으로 제거합니다. 작은 스프링 가위를 사용하여 눈을 제거합니다. 두개골을 열고 브레이크와 두뇌의 복부 측면에서 뼈를 제거합니다. 지금은 PBS의 접시에 머리를 장소와 뇌의 등의 측면에서 피부와 두개골 뼈를 제거합니다.
- , telencephalon, habenula, 광 tectum, 소뇌 및 모수 (., 실링, 2002 그림 8, Wullimann 외, 1996) 후각 구근을 확인합니다.
그림 8. 해부 성인 zebrafish의 뇌. 맨 앞쪽에 도설보기.
Disclosures
동물 실험은 펜실베니아 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 MCM과 TG에 미국 암 협회 박사 과정 이수 원정대 # PF - 05-041 - 01 - DDC에 NIH R01 부여 HD050901에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0 |
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| Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O |
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| Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2 |
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| Dissecting dish with mat | Electron Microscopy Sciences | 70540 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
References
- Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
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- Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
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- Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).
