Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء تشريح لتحديد وأعضاء من الزرد الكبار.
Abstract
على مدى السنوات ال 20 الماضية ، أصبح الزرد كائن نموذج قوية لفهم تطور الفقاريات والمرض. على الرغم من التحليل التجريبي للجنين واليرقة واسعة النطاق ، وقد وثقت التشكل جيدا ، وصفا للتشريح الزرد الكبار والدراسات لتنمية الهياكل الكبار وأجهزتها ، وجنبا إلى جنب مع تقنيات العمل مع الكبار مفتقدة. أجهزة اليرقة تخضع لتغييرات كبيرة في بنيتها الشاملة ، مورفولوجيا ، وموقعها التشريحي اليرقات خلال الانتقال إلى الكبار. خارجيا ، ويرقة شفافة تتميز به من تطور نمط أخلاقي الصباغ شريطية وزعانف الحوض مقترن ، بينما داخليا ، والخضوع لأجهزة النمو الهائل والتجديد. إضافة إلى ذلك ، منشم الغدد التناسلية إما ثنائي المكنة تطور الى الخصية أو المبيض. ويحدد هذا البروتوكول العديد من أجهزة الكبار ويوضح طرائق تشريح الدماغ والغدد التناسلية ، الجهاز الهضمي والقلب والكلى من الزرد الكبار. ويمكن استخدام أجهزة تشريح للتهجين في الموضع التقنيات الجزيئية المناعية ، الأنسجة ، استخراج الحمض النووي الريبي ، وتحليل البروتين ، وغيرها. وسيساعد ذلك البروتوكول في توسيع نطاق الدراسات في الزرد لتشمل إعادة تشكيل الأجهزة اليرقات ، والتشكل من أجهزة معينة للتحقيقات الكبار وغيرها من نظم الجهاز الكبار.
Protocol
- وسيتم تشريح والزرد الرجال أولا ، تليها الأسماك الإناث. قبل البدء في عملية التشريح ، تخدير سمكة في Tricaine 0.2 ٪ ومن ثم الموت ببطء من قبل الحضانة في الماء المثلج لمدة 15 دقيقة.
- أبدأ التربيت بخفة السمك الجاف على منشفة ورقية ، ووضعه على حصيرة تشريح. خارجيا ، الزرد واحدة ظهرية والزعانف الذيلية والشرجية وإقران الزعانف الصدرية والحوض (الشكل 1).
الشكل 1. الأسماك الذكور البالغين مع زعانف المسمى. - دبوس الأسماك إلى تشريح حصيرة من خلال الجزء السمين من الذيل والجزء البطني من تجويف العين.
- قص الجلد على بطن السمكة الأمامي فقط على الزعنفة الشرجية. قطع الجلد والعضلات الكامنة على طول البطن من الزعنفة الشرجية لالوصاد (وهي غطاء الثابت على مدى جيل) (الشكل 2 ، الخطوة 1).
الشكل 2. خطوات في إزالة الجلد والعضلات جدار الجسم للكشف عن الأعضاء الداخلية. - المقبل ، إزالة الوصاد والزعانف الصدرية ، بما في ذلك حزام الصدرية (وسميكة ، والمنطقة العظمية عند قاعدة الزعنفة) (الشكل 2 ، الخطوة 2). قطع الجلد والعضلات الأساسية بداية من فوق الخلف الخيشومية تعرض الآن على طول الجانب من الأسماك ومن ثم وصولا الى الزعنفة الشرجية (الشكل 2 ، الخطوة 3).
- إزالة بعناية الجلد والعضلات الأساسية من جانب السمك. العديد من الأعضاء الداخلية هي الآن مرئية (الشكل 3).
إزالة الرقم 3. الأسماك الذكور البالغين مع جدار الجسم والعضلات مما يتيح للتصور من الأعضاء الداخلية. - الخصيتين هي ، بيضاء طويلة ، وأجهزة المقترنة التي تعلق على جدار الجسم الظهرية. إزالة الخصية ووضعه في طبق من برنامج تلفزيوني. فحص الخصية مع الضوء المنعكس على تصور الأنابيب المنوية (الشكل 4) ، والتي تحتوي على الأكياس مع مراحل مختلفة من الخلايا الجرثومية النامية من spermatagonia إلى أرومة النطفة (ليال وآخرون ، 2009).
الشكل 4. تشريح للخصية. هياكل بيضاء مدور هي الأنابيب المنوية. - المقبل ، إزالة الجهاز الهضمي من تجويف الجسم من الأسماك. يمكن التعرف على الكبد بحجمه الكبير ، مورفولوجيا الفصوص ، واللون tannish ، والأوعية الدموية واسعة النطاق. تم العثور على المرارة ، خضراء شفافة كيس السائل شغلها ، والطحال ، والذي يظهر أحمر مشرق ، في الأحشاء.
- فصل الأمعاء عن بقية الأجهزة وتمتد بها. يتم تعريف الأمامية ، ومناطق متوسطة ، والخلفي للأمعاء من طول طيات الظهارية (والاس وآخرون ، 2005).
- ضع قطعة من الأمعاء في برنامج تلفزيوني ومراقبة طيات الطلائية باستخدام الضوء المرسل.
- المقبل ، لفحص المثانة السباحة. المثانة السباحة يتكون من غرفة الخلفي ، الذي يرتبط المريء عبر القناة الهوائية ، والغرفة الأمامية ، وهذا مرتبط إلى الأذن الداخلية من خلال جهاز Weberian (فيني وآخرون ، 2006).
- إزالة وتجاهل المثانة السباحة. نزع الدبوس الأسماك وإعادة يعلقون عليه الجانب البطني تصل إلى تشريح الكلى ، والذي يقع على طول جدار الجسم الظهرية. الكلى هو بنية شفافة الوردي المرتبطة الأبهر الظهري والخلايا الصباغية. وتنقسم الى مناطق الكلى الرأس والجسم ، والذيل (الشكل 5). تشريح قطعة من الكلى ووضعه في برنامج تلفزيوني. ندف تمزيق نسيج الكلى للكشف عن الأنابيب الكلوية.
الشكل 5. المكان الرأس والجسم ، والذيل والكلى على طول جدار الجسم الظهرية. - تشريح الأسماك الإناث. كما هو موضح سابقا ، والموت ببطء السمك في الماء المثلج وبات تجف قبل أن تعلق على حصيرة تشريح. إزالة الجلد من جانب السمك كما هو موضح سابقا. المبيض هو هيكل مزدوج الفص التي علقت في تجويف الجسم بواسطة mesovarium أوعية دموية.
- إزالة أحد الفص من المبيض ، وضعه في برنامج تلفزيوني ، وبحث مع الضوء المرسل. يمكن أن يكون مثار البويضات باستخدام الإبر باستثناء الغرامة وقام بعد ذلك (الشكل 6 ، سلمان وآخرون ، 1993). المرحلة الأولى هي البويضات حوالي 10 -- 150 ميكرون في الحجم وشفافة. المرحلة الثانية البويضات حوالي 150-350 ميكرون في الحجم والتي حددها ظهور حبيبات القشرية. المرحلة الثالثة هي البويضات 350-750 ميكرون في الحجم ومبهمة بسبب تراكم الصفار. مرحلة النضج الرابع والخامس والبويضات شفافة وعموما لم يتم العثور في مبايض الاناث التي تزاوج في الآونة الأخيرة.
الشكل 6. مرحلة لايف الأول والثاني والثالث والبويضات تحت الملاحظةتشريح المجهر مع الضوء المرسل. - المقبل ، تشريح القلب من الأسماك. يقع في قلب الخلفي وبطني الى الخياشيم. يبدأ عن طريق الاستغناء عن القلب وجميع الأنسجة المحيطة بها ووضعه في برنامج تلفزيوني. تشريح بعناية بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها القلب ، والحرص على عدم الاضرار الأذين الحساسة.
- مكان القلب في حل تشريح رينغر لمراقبة ضربات القلب.
تحديد الأذين ، البطين ، والشريانية بصلة (الشكل 7 ، هو وآخرون ، 2001).
الشكل 7. تشريح القلب الكبار. - إكمال تشريح الدماغ عن طريق إزالة من الأسماك. أبدأ unpinning الأسماك وإزالة الرأس مع شفرة الحلاقة. إزالة الأنسجة اللينة وأكبر قدر ممكن من الجانب البطنية من الجمجمة مع ملقط. إزالة العيون باستخدام مقص صغير الربيع. كسر فتح الجمجمة وإزالة العظام من الجانب البطنية من الدماغ. الآن مكان رأسه في طبق من برنامج تلفزيوني وإزالة عظام الجمجمة والجلد من الجانب الظهري من الدماغ.
- التعرف على بصيلات الشم ، telencephalon ، العنان ، سقف البصرية ، والمخيخ والنخاع (الشكل 8 ، Wullimann وآخرون ، 1996 ؛. شيلينغ ، 2002).
الشكل 8. تشريح الدماغ الزرد الكبار. عرض الظهرية ، الأمامي إلى أعلى.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة ولاية بنسلفانيا لرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HD050901 إلى مليون متر مكعب وزمالة جمعية السرطان الاميركية بعد الدكتوراة # PF - 05 - 041 - 01 - DDC إلى TG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0 |
|||
| Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O |
|||
| Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2 |
|||
| Dissecting dish with mat | Electron Microscopy Sciences | 70540 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
References
- Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio). J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).
- Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish. Anat Rec. 264, 1-12 (2001).
- Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).
- Schilling, T. F. The morphology of larval and adult zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio. J. Morphol. 218, 203-224 (1993).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech Dev. 122, 157-173 (2005).
- Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).
