Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הליך זיהוי ביתור איברים דג הזברה הבוגרת.

Abstract

במהלך 20 השנים האחרונות, דג הזברה הפכה אורגניזם מודל רב עוצמה להבנת התפתחות המחלה לבין החוליות. אמנם ניתוח ניסיוני של העובר ואת הזחל הוא נרחב את המורפולוגיה תועד היטב, תיאורים של אנטומיה דג הזברה מבוגרים מחקרים בהתפתחות של מבנים ואיברים מבוגר, יחד עם טכניקות לעבודה עם מבוגרים חסרים. האיברים של הזחל עוברים שינויים משמעותיים במבנה הכולל שלהם, מורפולוגיה, ואת המיקום האנטומי במהלך הזחל כדי המעבר מבוגר. חיצונית, הזחל מתפתח שקוף המאפיין מבוגרים פסים שלה פיגמנט דפוס סנפירי גחון לזווג, בעוד פנימי, איברים עוברים צמיחה שיפוץ מסיבי. בנוסף, primordium bipotential אשך מתפתח אשך או השחלה. פרוטוקול זה מזהה רבים מן האיברים של המבוגר ומדגים שיטות לניתוח של המוח, בלוטות המין, מערכת העיכול, הלב, הכליות של דג הזברה הבוגרת. איברים גזור ניתן להשתמש ב הכלאה באתרו, בטכניקות מולקולריות אימונוהיסטוכימיה, היסטולוגיה, מיצוי RNA, ניתוח חלבון, ועוד. פרוטוקול זה יסייע הרחבת לימודי דג הזברה לכלול את שיפוץ של איברים הזחל, המורפוגנזה של איברים ספציפיים החקירות בוגרים אחרים של מערכות איברים בוגרים.

Protocol

1. דג הזברה זכר יהיה גזור הראשון, ואחריו דג ממין נקבה. לפני תחילת הניתוח, להרדים דג Tricaine 0.2% ואז להרדים אותו על ידי הדגירה במי קרח למשך 15 דקות.
2. בגין, טופח קלות על ידי דג יבש על מגבת נייר והניח אותו על מחצלת לנתח. חיצונית, דג הזברה יש אחד הגבי, סנפירי הזנב ואת אנאלי סנפירי החזה והאגן לזווג (איור 1).
   
   
   
   באיור 1. דג זכר בוגר עם סנפירים שכותרתו.
   
3. הצמד את הדגים המחצלת לנתח דרך החלק הבשרי של הזנב ואת החלק הגחוני של ארובת העין.
4. Snip את העור על הבטן של הדג הקדמי רק סנפיר אנאלי. חותכים את העור, השרירים הבסיסית לאורך הבטן של סנפיר אנאלי operculum (כיסוי קשיח מעל הזימים) (איור 2, שלב 1).
   
   
   
   איור 2. שלבים הסרת העור קיר השרירים בגוף לחשוף את האיברים הפנימיים.
   
5. בשלב הבא, להסיר את operculum ואת סנפיר החזה, כולל חגורת החזה (אזור עבה, גרמית בבסיס סנפיר) (איור 2, שלב 2). חותכים את העור ואת תחילת שריר הבסיסית מלמעלה חשוף עכשיו בדיעבד הזימים בצד של הדג, ואז למטה סנפיר אנאלי (איור 2, שלב 3).
6. בזהירות להסיר את העור ואת השרירים הבסיסית מהצד של הדג. רבים מן האיברים הפנימיים נמצאים כעת גלוי (איור 3).
   
   
   
   איור 3. דג זכר בוגר עם קיר הגוף ושרירים להסיר המאפשר הדמיה של האיברים הפנימיים.
   
7. האשכים הם ארוכים, לבנים, איברים לזווג המחוברים לקיר הגוף הגבי. הסרת testis ולמקם אותו בצלחת של PBS. בדוק את testis עם האור המוחזר לדמיין את tubules seminiferous (איור 4), אשר מכילים ציסטות עם השלבים השונים של בתאי הנבט המתפתח מן spermatagonia כדי spermatids (ליאל et al. 2009).
   
   
   
   איור 4. Dissection של אשך. המבנים עגלגל לבן הם tubules seminiferous.
   
8. בשלב הבא, להסיר את מערכת העיכול מחלל הגוף של הדג. הכבד ניתן לזהות על ידי גודל גדול שלה, מורפולוגיה אונות, צבע כותונת חומה בהירה, ואת כלי דם רב. כיס המרה, שק ירוק מלאות נוזל שקוף, ואת הטחול, המופיע בצבע אדום בוהק, נמצאים בתוך הקרביים.
9. הפרד את המעי משאר האיברים ולמתוח אותו. קדמית, אזורים באמצע, ואת האחורי של המעי מוגדרים על ידי גובה של קפלי אפיתל (Wallace et al. 2005).
10. מניחים פיסת המעי ב PBS ולבחון את קפלי האפיתל באמצעות האור המועבר.
11. לאחר מכן, לבחון את שלפוחית ​​השחייה. שלפוחית ​​השחייה מורכב בתא האחורי, אשר מחובר אל הוושט באמצעות צינור פנאומטי, וכן תא קדמי, אשר מחובר אל האוזן הפנימית באמצעות המנגנון Weberian (פיני et al. 2006).
12. הסר לבטל את שלפוחית ​​השחייה. הסר את הדג מחדש פינים זה בצד הגחון עד לנתח את הכליה, הנמצא לאורך הקיר הגוף הגבי. בכליות הוא מבנה ורוד שקוף הקשורים באבי העורקים הגב ותאי פיגמנט. הכליה מחולקת לאזורים ראש, גוף וזנב (איור 5). לנתח את פיסת הכליה ולמקם אותו PBS. ניסתה להפריד רקמות כליה כדי לחשוף את tubules כליות.
    
    
    
    איור 5. מיקום של הראש, הגוף, כליות הזנב לאורך הקיר הגוף הגבי.
    
13. לנתח דג ממין נקבה. כפי שתואר קודם לכן, להרדים את הדג במי קרח וללטף לו להתייבש לפני מצמיד אותו למזרן לנתח. הסר את העור מן הצד של הדג כפי שהודגם קודם לכן. השחלה הוא מבנה bilobed כי הוא מושעה בחלל הגוף על ידי mesovarium vascularized.
14. להסיר את אחד באונה של השחלה, למקם אותו PBS, ולבחון אותה עם האור המועבר. ביציות ניתן התגרו בנפרד באמצעות מחטים דקות ואז מבוים (איור 6, סלמן et al. 1993). אני ביציות שלב כ 10-150 מיקרון ו - שקוף. שלב II ביציות כ 150-350 מיקרון בגודל שהוגדר על ידי הופעתו של גרגרי קליפת המוח. שלב III ביציות הן 350-750 מיקרון והם אטום בשל הצטברות של חלמון. בוגר IV ו-V ביציות בשלב שקופים ובאופן כללי לא נמצא את השחלות של נקבות אשר הזדווגו לא מזמן.
    
    
    
    איור 6. בשלב חי I, II, III ו ביציות שנצפה תחתלנתח מיקרוסקופ עם האור המועבר.
    
15. בשלב הבא, לנתח את הלב מן הדגים. הלב ממוקם האחורי ו הגחון של הזימים. בגין על ידי חיתוך את הלב ואת כל הרקמה הסובבת ומעמידים אותו PBS. משם לנתח בזהירות את הרקמה שמסביב ללב, נזהר לא לפגוע אטריום עדין.
16. מניחים את הלב גזור לתוך הפתרון של רינגר לקיים את פעימות הלב.
    זהה את אטריום, החדר, ואת bulbus arteriosus (איור 7, הו et al., 2001).
    
    
    
    איור 7. ניתח לב מבוגר.
    
17. השלם את לנתיחה על ידי הסרת המוח של הדגים. בגין על ידי שלפה את הסיכות את הדגים להסיר את הראש עם סכין גילוח. הסרה של רקמות רכות כמו כמה שיותר מהצד הגחוני של הגולגולת עם מלקחיים. הסר את העיניים בעזרת מספריים מעיין קטן. Break לפתוח את הגולגולת ולהוציא את העצם מהצד הגחוני של המוח. עכשיו מקום ראש בצלחת של PBS ולהסיר את עצמות הגולגולת העור מהצד הגבי של המוח.
18. זהה את נורות חוש הריח, telencephalon, habenula, tectum אופטיים, המוח הקטן ואת לשד (איור 8, Wullimann et al, 1996;. שילינג, 2002).
    
    
    
    איור 8. ניתח מוח דג הזברה מבוגר. להציג הגבי, קדמית למעלה.
    

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) 200 mg tricaine powder 97.9 ml DD water ~1 ml 1 M Tris (pH 9) Adjust pH to 7.0
Phosphate buffered saline (PBS) 4.0 g NaCl 0.1 g KCl 100 ml 0.1 M PO4 Buffer, pH 7.3 150 ml dH2O
Ringer’s solution 6.7g NaCl 0.2g KCl 0.2g CaCl2 1.2g Hepes 1 L H2O Adjust pH to 7.2
Dissecting dish with mat	Electron Microscopy Sciences	70540
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09