मोज़ेक बढ़ाने दृश्यों का मूल्यांकन के लिए Zebrafish Transgenesis

Summary

हम developmentally विनियमित जीन से संभावित बढ़ाने तत्वों को खोजने और मोज़ेक zebrafish transgenesis के माध्यम से उनके कार्य का मूल्यांकन करने के लिए हमारे दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है.

Abstract

मानव जीनोम अनुक्रम का पूरा, कि कई अन्य प्रजातियों के साथ, गैर कोडन दृश्यों के लिए विशिष्ट समारोह ascribing की चुनौती पर प्रकाश डाला गया है. एक प्रमुख जीनोम की गैर कोडन अंश से बाहर किए गए एक समारोह के जीन प्रतिलेखन विनियमित करने के लिए है, तथापि, वहाँ कोई कारगर तरीकों के लिए मोटे तौर पर प्राथमिक डीएनए अनुक्रम से सीआईएस नियामक तत्वों की भविष्यवाणी कर रहे हैं. हम एक कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया है कार्यात्मक zebrafish transgenesis के माध्यम से संभावित सीआईएस नियामक तत्वों का मूल्यांकन. हमारा दृष्टिकोण developmentally महत्वपूर्ण जीनों के लिए सेल संस्कृति आधारित तकनीकों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है, के बाद से यह स्थानिक और लौकिक जीन विनियमन पर जानकारी प्रदान करता है. इसके विपरीत, यह तेजी से और कम ट्रांसजेनिक चूहों में इसी तरह के प्रयोगों की तुलना में महंगा है, और हम नियमित मानव जीनोम से अलग दृश्यों के लिए लागू है. यहाँ हम परीक्षण के लिए अनुक्रम और क्लोनिंग के दृश्यों के लिए हमारी प्रोटोकॉल के संरक्षण पर आधारित है और उन्हें zebrafish भ्रूण में microinjecting तत्वों का चयन हमारे दृष्टिकोण का प्रदर्शन.

Protocol

1. चयन और परीक्षण के लिए संरक्षित दृश्यों की क्लोनिंग

1. एक पहले कार्यात्मक परीक्षण के लिए संभावित विनियामक अनुक्रम की पहचान करना चाहिए. हम दृश्यों का चयन मापदंड के रूप में विकासवादी अनुक्रम संरक्षण पर भरोसा करते हैं, और सबसे अक्सर एल्गोरिथ्म PhastCons, जो UCSC जीनोम ब्राउज़र (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) पर एक ट्रैक के रूप में पहुँचा जा सकता है का उपयोग करें. हालांकि, वहाँ कई अन्य प्रजातियों भर में अनुक्रम संरक्षण का मूल्यांकन करने के लिए उपलब्ध एल्गोरिदम रहे हैं.
2. एक बार जब हम अपने अनुक्रम का चयन किया है, हम प्राइमरों डिजाइन जीनोमिक डीएनए से प्रत्येक अनुक्रम बढ़ाना. प्राइमर्स प्लस दोनों तरफ संरक्षित क्षेत्र में 30 या उससे अधिक बेस जोड़े बढ़ाना चुना जाना चाहिए.
3. चयनित दृश्यों के प्रवर्धन के लिए हम Takara के ला TaqTM प्रणाली का उपयोग करें. अन्य पोलिमेरासिज़ काम है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है एक मिश्रण है कि proofreading क्षमता के साथ एक एंजाइम शामिल का उपयोग करने के लिए, प्रवर्धन के दौरान शुरू की त्रुटियों की संभावना को कम करने. हम amplicon आकार agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सत्यापित करें.
4. हम पीसीआर 8/GW/TOPO टीए क्लोनिंग किट (Invitrogen) एक प्रविष्टि attL पुनर्संयोजन साइटों युक्त वेक्टर में पीसीआर उत्पाद क्लोन करने के लिए, गेटवे प्रविष्टि क्लोन उत्पन्न का उपयोग करें. क्लोनिंग प्रतिक्रिया ताजा पीसीआर उत्पाद के साथ अधिक कुशल है, तो यह सबसे अच्छा है पीसीआर के एक दिन के भीतर क्लोनिंग प्रदर्शन है. DH5α उपभेदों में परिवर्तन किया जाता है spectinomycin प्रतिरोध चयन द्वारा पीछा किया.
5. हम ~~ EcoRI साथ प्लाज्मिड के 500ng के पाचन से टीए क्लोनिंग के उत्पाद की पुष्टि सम्मिलित करने के लिए जारी है, और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डालने के आकार की पुष्टि. हम डालने के अनुक्रम और ओरिएंटेशन को सत्यापित अनुक्रमण की सिफारिश की, प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों भी अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
6. प्रविष्टि क्लोन से, गैर कोडन संरक्षित अनुक्रम LR पुनर्संयोजन द्वारा हमारे गेटवे तैयार गंतव्य वेक्टर, pGW_cfosGFP1, गेटवे LR Clonase द्वितीय एंजाइम मिक्स (Invitrogen) का उपयोग करने के लिए shuttled है. DH5α उपभेदों में परिवर्तन किया जाता है एम्पीसिलीन प्रतिरोध चयन द्वारा पीछा किया.
7. हम ~~ EcoRV साथ प्लाज्मिड के 500ng के पाचन से LR पुनर्संयोजन के उत्पाद की पुष्टि सम्मिलित करने के लिए जारी है, और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डालने के आकार की पुष्टि. एक बार एक सटीक क्लोन की पहचान की गई है, हम प्लाज्मिड Qiagen HiSpeed ​​का उपयोग डीएनए ® प्लाज्मिड Midi किट तैयार करते हैं. हम आगे QIAquick पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर प्लाज्मिड शुद्ध निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, और 30 μL RNase मुक्त पानी के साथ डीएनए elute. प्लाज्मिड 125 के एक एकाग्रता / एनजी μL और 4 में संग्रहीत ° सी पहले इंजेक्शन के लिए पतला है.
8. आरएनए एन्कोडिंग कार्यात्मक Tol2 transposase एंजाइम इन विट्रो में pDB600 plasmid2 से लिखित है. हम प्लाज्मिड Qiagen किट Midi-तैयारी का उपयोग कर शुद्ध, तो XbaI साथ 10-20 μg linearize. mRNA संश्लेषण बाहर mMESSAGE mMACHINE किट प्रोटोकॉल (Ambion) के बाद किया जाता है.
9. हम शुद्ध और किट निर्देशों के अनुसार शाही सेना वेग. हम ~ 1μg/μl की अंतिम एकाग्रता, या एक एकल प्रतिक्रिया के लिए 20 μl आरएनए resuspend RNase मुफ्त पानी में, और यूवी spectrophotometry द्वारा यों. हम भी ~ 1μg agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा शाही सेना के विश्लेषण करने के लिए पूरी लंबाई प्रतिलेखन सत्यापित. हालांकि एक मानक TAE या TBE जेल इस विश्लेषण के लिए पर्याप्त है, denaturing नमूना प्रतिलेखन किट के साथ शामिल बफर किट निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
10. हम प्रभावकारिता के लिए एक ज्ञात प्लाज्मिड (चित्रा 1) के साथ इंजेक्शन के प्रदर्शन से transposase शाही सेना के प्रत्येक नए बैच परीक्षण. सत्यापन के बाद, आरएनए छोटे aliquots में बांटा गया है और -80 पर संग्रहीत ° सी, दोहराया विगलन और व्यक्तिगत aliquots के refreezing से बचने के लिए.
    
    चित्रा 1. Zebrafish भ्रूण एक नियंत्रण (शीर्ष) brightfield (नीचे) छवि GFP प्रतिदीप्ति छवि के रूप में माउस Sox10 बढ़ाने के साथ अंतःक्षिप्त. Transposase शाही सेना के प्रत्येक नया बैच प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया है.

2. Zebrafish भ्रूण के मोज़ेक ट्रांसजेनिक विश्लेषण के लिए Microinjection

1. हम एक के लिए एक काफी तेज बरकरार chorions घुसना शंकु के साथ एक मजबूत टिप उपज कार्यक्रम तैयार के साथ 1.2 मिमी आयुध डिपो पर एक Sutter पी 97 micropipette डांड़ी रेशा केशिका गिलास से microinjection के लिए सुई, खींचो. हम एक stereomicroscope के तहत हाथ से सुझावों को तोड़ने लगभग 15 सुक्ष्ममापी की एक बाहरी व्यास एक साफ रेजर ब्लेड और एक micrometer स्लाइड का उपयोग कर. सुई इंजेक्शन पहले दिन हो किया जा सकता है, और एक कवर जोत डिश में संग्रहीत को साफ रखना.
2. हम एक नियमित रूप से प्रकाश अंधेरे चक्र पर हमारे zebrafish बनाए रखने के लिए, प्रकाश की 14 घंटे के साथ मानक के तहत conditions3,. दिन प्रदर्शन microinjections से पहले, हम छोटे प्रजनन टैंक, प्रत्येक एक आधार टैंक से मिलकर, एक slotted डालने, और एक प्लास्टिक के ढक्कन में समय matings के लिए मछली सेट. हम तीन महिलाओं या टी के अनुसार दो पुरुषों की जगहसमानांतर पंक्तियों में ank.
3. Microinjections की सुबह में, के बाद शीघ्र ही प्रकाश चक्र शुरू होता है है, हम स्वच्छ पानी की व्यवस्था इलाज में अंडा उत्पादन के लिए पुरुषों और महिलाओं के संयोजन शुरू. यह महत्वपूर्ण है अक्सर मछली पर जांच और अंडे बिछाने के कुछ ही मिनटों के भीतर एकत्र, के लिए अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ बैचों प्राप्त है. अंडों का उत्पादन दो से तीन घंटे के लिए बनाए रखा जा सकता है, सुबह भर में मछली की ताजा समूहों के गठबंधन द्वारा जारी है.
4. एक विस्तृत बोर के साथ 5 1 / 4 "कांच पाश्चर विंदुक एक लाटेकस बल्ब के साथ फिट, हम 60 x 15 मिमी पेट्री डिश, 50 भ्रूण के समूहों में आंशिक रूप से भ्रूण Medium2 से भरा है, में एकत्र भ्रूण तरह, और निशान समय पर एकत्र हर डिश के ढक्कन.
5. एक बार मछली बिछाने शुरू कर दिया है, हम बर्फ पर एक microfuge ट्यूब में निम्न मिश्रण से ताजा इंजेक्शन समाधान तैयार:

   घटक
   Transposon प्लाज्मिड शेयर (125ng/μl)	1μl
   Transposase आरएनए शेयर (175ng/μl)	1μl
   Phenol लाल स्टॉक (एच 2 हे में 2%)	0.5μl
   RNase मुफ्त पानी	2.5μl

   
   इंजेक्शन सुई बर्तन पकड़े में रखी हैं और प्रत्येक सुई के व्यापक अंत पर इंजेक्शन समाधान के 500 nl बूँदें pipetting द्वारा भरा. बाद तरल केशिका क्रिया के माध्यम से टिप करने के लिए तैयार है, अतिरिक्त 1.5-2 μl की कुल समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है. हम प्रत्येक इंजेक्शन समाधान के लिए कम से कम दो सुइयों तैयार करते हैं.
6. भरा सुई हाथ एक वायवीय पिको पम्प या इसी तरह के दबाव सुई लगानेवाला, कॉन्फ़िगर है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक N2 टैंक से जुड़ा की सुई धारक आयोजित में भरी हुई है. हम एक micrometer स्लाइड पर खनिज तेल में निष्कासित कर दिया बूंदों के व्यास को मापने के द्वारा इंजेक्शन संस्करणों जांचना. आमतौर पर, 120 एमएस के एक 20 साई के एक दबाव के साथ इंजेक्शन समय लगभग 1 nl की एक छोटी बूंद उपज जाएगा है, लेकिन सुई व्यास में मामूली बदलाव के इन मानकों को प्रभावित और recalibration सुइयों के बीच आवश्यक हो सकता है है.
7. इंजेक्शन 6-10X आवर्धन पर stereomicroscope के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं. हम ठीक संदंश की एक जोड़ी के लिए जगह में भ्रूण पकड़, chorion के माध्यम से और एक भ्रूण की जर्दी में एक कक्ष या जल्दी दो सेल मंच पर लगातार दबाव के साथ इंजेक्शन सुई धक्का का उपयोग करें. आदर्श रूप में, हम सिर्फ blastomeres नीचे जर्दी में सुई टिप स्थिति. इंजेक्शन समाधान के लगभग 1 nl निष्कासित कर दिया है और सुई वापस ले लिया. प्रत्येक निर्माण के लिए हम ≥ 200 भ्रूण इंजेक्षन. यह भी बहुत महत्वपूर्ण है, एकत्र भ्रूण के प्रत्येक क्लच के लिए, uninjected नियंत्रण भ्रूण के एक डिश बचा.
8. इंजेक्शन पूरा करने के बाद हम unfertilized अंडे, क्षतिग्रस्त भ्रूण, और असफल इंजेक्शन blastomeres में कोई phenol के लाल के साथ (भ्रूण) को हटाने के द्वारा भ्रूण सॉर्ट. हम तो 28.5 पर टिप्पणियों के लिए डिग्री सेल्सियस उचित समय तक भ्रूण मध्यम में भ्रूण को सेते हैं.

3. मोज़ेक अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण

1. एक उपयुक्त ऊष्मायन समय के बाद, हम प्रतिदीप्ति के लिए इंजेक्शन भ्रूण की जांच. समय अंतर्जात zebrafish जीन की सामान्य अभिव्यक्ति पैटर्न पर निर्भर करता है, लेकिन हम आम तौर पर पहले 5 दिनों के बाद निषेचन के माध्यम से दैनिक देखो.
2. हम एक ओलिंप MVX10 epifluorescence के लिए फिट macroscope पर प्रतिदीप्ति के लिए भ्रूण की जांच, लेकिन किसी भी तरह कम बिजली इमेजिंग में सक्षम माइक्रोस्कोप काम करेंगे. अगर वहाँ है कि मर गया है या असामान्य रूप से पहले दिन में विकसित भ्रूण की एक बड़ी संख्या में हैं, कि क्लच लिए uninjected नियंत्रण पर देखने के लिए यदि वे सामान्य दिखता है. यदि नियंत्रण सामान्य दिखता है, सबसे आम समस्या इंजेक्शन डीएनए के अपर्याप्त पवित्रता है. इसके अलावा, प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण इंजेक्शन प्लाज्मिड की कुल राशि के प्रति संवेदनशील हैं, तो यह संभव है कि मात्रा का ठहराव गलत था और बहुत ज्यादा डीएनए इंजेक्ट किया गया था.
3. जब भ्रूण की जांच, यह ध्यान में रखना है कि वे सभी इंजेक्शन का निर्माण के लिए मोज़ेक जाएगा. यह भ्रूण के सभी पर ध्यान से देखो करने के लिए आवश्यक हो सकता है, खासकर अगर अभिव्यक्ति की उम्मीद डोमेन छोटा है. यह भी याद है कि अभिव्यक्ति गतिशील किया जा सकता है; 1 दिन पर मजबूत प्रतिदीप्ति 2 दिन, और नकारात्मक अभिव्यक्ति के लिए पहले 3 दिन 4 दिन पर कुछ दिखाने सकता है भ्रूण से गायब हो सकता है.
4. हम और अधिक व्यापक अभिव्यक्ति के साथ कुछ भ्रूण चुनते हैं, और इन का उपयोग करने के लिए photomicroscopy द्वारा प्रतिदीप्ति के पैटर्न दस्तावेज़. टिप्पणियों के 5 दिनों के बाद भ्रूण की सुविधा के लिए लौट जाना चाहिए और एक शेयर के रूप में उठाया. कई महीनों में, वयस्कों transgenes के germline संचरण के लिए जांच की जा सकती है.

4. परिणाम

हम एक विस्तृत ध् देखते हैंपैटर्न और अभिव्यक्ति के स्तर के ariety बढ़ाने तत्व विश्लेषण किया जा रहा है पर निर्भर करता है. हम आम तौर पर बहुत ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न में रुचि रखते हैं, और अक्सर कंकाल में व्यक्त जीनों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. और अक्सर कंकाल में व्यक्त जीनों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. चित्रा 2 मोज़ेक अभिव्यक्ति पैटर्न के उपास्थि और हड्डी में अभिव्यक्ति विनियमन enhancers के साथ हम हमारे इंजेक्शन भ्रूण में मनाया है, उदाहरण दिखाता है. अंत में, परीक्षण अनुक्रम का एक बड़ा भाग ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति को विनियमित नहीं करते. इन के लिए, हम सबसे अक्सर बहुत कम प्रतिदीप्ति, शायद भ्रूण प्रति कुछ बिखरे हुए कोशिकाओं देखें. कम अक्सर, हम प्रतिदीप्ति लेकिन अस्थानिक अभिव्यक्ति, epidermis और कंकाल की मांसपेशी (चित्रा 3) के लिए दो आम साइटों में ही देख सकते हैं.

चित्रा 2. उपास्थि और हड्डी अभिव्यक्ति इंजेक्शन भ्रूण में मनाया पैटर्न का उदाहरण.

चित्रा 3. बढ़ाने रिश्तेदार के जीन और अभिव्यक्ति के नियमन के लिए स्थान के बीच थोड़ा सहसंबंध परीक्षण अनुक्रम का एक बड़ा भाग है. ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति को विनियमित नहीं है. ये अक्सर बहुत कम प्रतिदीप्ति है, या अस्थानिक अभिव्यक्ति के लिए दो आम साइटों हो सकता है: epidermis और कंकाल की मांसपेशी. (शीर्ष) brightfield छवि (निचला) GFP प्रतिदीप्ति छवि.

Discussion

हम संभावित zebrafish transgenesis का उपयोग enhancers के कुशल विश्लेषण के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है. ज्यादातर अक्सर, हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए ऊतक विशिष्ट मानव जीन के साथ जुड़े enhancers के लिए देखो. स्पष्ट अनुक्रम समरूपता के अभाव के बावजूद मानव और गैर कोडन दृश्यों, हम पाते हैं कि इस दृष्टिकोण आमतौर पर हमारे लिए ब्याज की जीन के लिए enhancers की पहचान करने में सफल रहा है. मछली के बीच समय के सबसे सफलता के लिए महत्वपूर्ण कारकों प्लास्मिड डीएनए और transposase शाही सेना की तैयारी में देखभाल ले जा रहे हैं, और इंजेक्शन और प्रत्येक का निर्माण के लिए भ्रूण की एक पर्याप्त संख्या की जांच. transgene निर्माण, भ्रूण microinjections, और मोज़ेक अभिव्यक्ति विश्लेषण के सामान्य तरीकों के लिए कई अन्य प्रयोजनों के लिए ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों पैदा करने के लिए लागू होगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit	Invitrogen	K2500-20
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen	11791-100
Library efficiency competent cells DH5α	Invitrogen	12535-019
Library efficiency competent cells DB3.1	Invitrogen	11782-018
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion	AM1340
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820