Summary
Wir zeigen unseren Ansatz zur Suche nach potenziellen Enhancer-Elemente aus entwicklungsmäßig regulierten Genen und der Bewertung ihrer Funktion durch Mosaik Zebrafisch Transgenese.
Abstract
Die Fertigstellung des menschlichen Genoms, zusammen mit dem vieler anderer Arten, hat die Herausforderung zuzuschreiben bestimmte Funktion nicht kodierende Sequenzen hervorgehoben. Ein prominenter Funktion von den nicht codierenden Teil des Genoms ist es, Gentranskription regulieren, jedoch gibt es keine wirksamen Methoden, um im Großen und Ganzen vorherzusagen cis-regulatorische Elemente aus primären DNA-Sequenz. Wir haben ein effizientes Protokoll entwickelt, um funktionell zu bewerten potentielle cis-regulatorische Elemente durch Zebrafisch Transgenese. Unser Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber Zellkultur-Techniken für entwicklungspolitisch wichtige Gene, da sie Informationen über die räumliche und zeitliche Genregulation bietet. Umgekehrt ist es schneller und kostengünstiger als vergleichbare Experimente in transgenen Mäusen, und wir routinemäßig anwenden, um Sequenzen aus dem menschlichen Genom isoliert. Hier zeigen wir unseren Ansatz zur Auswahl von Elementen für die Prüfung auf der Grundlage Folge Erhaltung und unser Protokoll für das Klonen Sequenzen und Mikroinjektion sie in Zebrafisch-Embryonen.
Protocol
1. Auswahl und das Klonen von konservierten Sequenzen für die Prüfung
- Man muss zuerst potenzielle regulatorische Sequenzen für Funktionstests. Wir verlassen uns auf evolutionäre Sequenzanalyse Erhaltung als Kriterium, um Sequenzen zu wählen, und am häufigsten verwenden den Algorithmus PhastCons, die zugänglich wie ein Track auf der UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) ist. Es gibt jedoch viele andere Algorithmen zur Verfügung Sequenzkonservierung über Artgrenzen zu bewerten.
- Sobald wir unsere ausgewählten Sequenzen gestalten wir Primer an jeder Sequenz aus genomischer DNA zu amplifizieren. Primer so gewählt werden, die konservierte Region plus 30 oder mehr Basenpaare auf beiden Seiten zu verstärken.
- Zur Verstärkung des ausgewählten Sequenzen verwenden wir die Takara LA TaqTM System. Andere Polymerasen funktionieren wird, aber es ist wichtig, eine Mischung, die ein Enzym mit Korrekturlesen Fähigkeit beinhaltet verwenden, um die Chancen von Fehlern während der Amplifikation eingeführt zu minimieren. Wir überprüfen die Amplicongröße durch Agarosegelelektrophorese.
- Wir nutzen die pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), die PCR-Produkts in einem Eintrag Vektor, attL Rekombinationsstellen Klon, der Gateway-Eintrag Klon zu erzeugen. Das Klonen Reaktion ist effizienter mit frischen PCR-Produkt, so ist es am besten, um das Klonen innerhalb eines Tages der PCR führen. Transformation in DH5a Stämme durchgeführt, gefolgt von Spectinomycinresistenz Auswahl.
- Wir prüfen das Produkt aus der TA-Klonierung durch Verdauung von ~ 500 ng des Plasmids mit EcoRI, um den Einsatz freizugeben, und bestätigen Sie die Größe des Einsatzes durch Agarosegelelektrophorese. Wir empfehlen die Sequenzierung der Insert-Sequenz und Orientierung zu überprüfen; Primer für die Amplifikation verwendet werden, können auch für die Sequenzierung eingesetzt werden.
- Von den Eintrag zu klonen, ist die nicht-kodierenden konservierten Sequenz von LR-Rekombination zu unserem Gateway einsatzbereit Zielvektor, pGW_cfosGFP1 mit Gateway-LR Clonase II-Enzym-Mix (Invitrogen) gependelt. Transformation in DH5a Stämme durchgeführt, gefolgt von Ampicillinresistenz Auswahl.
- Wir prüfen das Produkt aus der LR-Rekombination durch Verdauung von ~ 500 ng der Plasmid mit EcoRV, um den Einsatz freizugeben, und bestätigen Sie die Größe des Einsatzes durch Agarosegelelektrophorese. Sobald ein genaues Klon identifiziert worden ist, bereiten wir Plasmid-DNA mit dem Qiagen HiSpeed ® Plasmid Midi Kit. Wir weiteren Reinigung des Plasmids mit dem QIAquick PCR Purification Kit nach Herstellerangaben Protokolle und eluieren die DNA mit 30 ul RNase freiem Wasser. Das Plasmid wird zu einer Konzentration von 125 ng / ul und bei 4 ° C vor Injektionen verdünnt.
- RNA kodieren funktionale TOL2 Transposase Enzym in vitro aus der pDB600 plasmid2 transkribiert. Wir reinigen das Plasmid mit dem Qiagen Midi-Prep-Kit, dann linearisieren 10-20 pg mit XbaI. Die mRNA-Synthese erfolgt nach dem mMESSAGE mMACHINE Kit-Protokoll (Ambion) durchgeführt.
- Wir reinigen und Fällung der RNA nach Montageanweisungen. Wir resuspendieren RNA bis zu einer Endkonzentration von ~ 1μg/μl oder 20 ul für eine einzige Reaktion, in RNase freiem Wasser, und zu quantifizieren, durch UV-Spektroskopie. Wir analysieren auch ~ 1 g der RNA durch Agarosegelelektrophorese in voller Länge Transkription zu überprüfen. Obwohl ein Standard-TAE-oder TBE-Gel ist für diese Analyse angemessen, sollte die Denaturierung Probenpuffer mit der Transkription-Kit enthalten nach kit Anweisungen verwendet werden.
- Wir testen jede neue Charge von Transposase RNA für die Wirksamkeit, indem Injektionen mit einem bekannten Plasmid (Abbildung 1). Nach der Überprüfung wird die RNA in kleine Portionen aufgeteilt und bei -80 ° C, um wiederholtes Auftauen und erneutes Einfrieren der einzelnen Aliquots zu vermeiden.
Abbildung 1. Zebrafisch-Embryo mit der Maus SOX10 Enhancer als Kontrolle. (Top) Hellfeldaufnahme (Bottom) GFP-Fluoreszenz Bild injiziert. Jede neue Charge von Transposase RNA ist für die Wirksamkeit getestet.
2. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen für die Mosaik-transgenen Analyse
- Wir ziehen die Nadeln für die Mikroinjektion von 1,2 mm OD Filament Kapillare aus Glas auf einem Sutter P-97 Micropipette Puller, mit einem Programm entwickelt, um eine starke Spitze mit einem ziemlich scharfen Kegel auf intakte Chorion dringen Ertrag. Wir brechen die Spitzen von Hand unter einem Stereomikroskop mit einem äußeren Durchmesser von ca. 15 m, mit einem sauberen Rasierklinge und einem Mikrometer gleiten. Die Nadeln können am Vortag Injektionen und dort gespeichert werden in einer überdachten hält Teller sauber zu halten.
- Wir halten an unserer Zebrafisch auf einer regelmäßigen Hell-Dunkel-Zyklus, der mit 14 Stunden Licht, unter Standard-conditions3. Der Tag vor der Durchführung microinjections, haben wir Fisch für zeitgesteuerte Paarungen in kleinen Aufzuchtbecken, jeweils bestehend aus einer Basis-Tank, einen geschlitzten einfügen, und einem Kunststoff-Deckel. Wir stellen drei Weibchen oder zwei Männchen pro tank in parallelen Reihen.
- Am Morgen des microinjections, kurz nachdem das Licht beginnt, starten wir die Kombination von Männchen und Weibchen in einem sauberen System-behandeltem Wasser für die Eiererzeugung. Es ist wichtig, auf die Fische häufig zu überprüfen, und sammeln die Eier innerhalb von wenigen Minuten von der Verlegung zu gut synchronisiert Chargen zu bekommen. Eierproduktion kann für zwei vor drei Stunden aufrecht erhalten werden, indem sie weiterhin an die frische Gruppen von Fischen im Laufe des Vormittags zu kombinieren.
- Mit einem breiten Bohrung, 5 1 / 4 "Glas Pasteur Pipette mit einem Latex-Glühlampe, sortieren wir die gesammelten Embryonen in 60 x 15 mm Petrischalen, teilweise mit Embryo Medium2 gefüllt, in Gruppen von 50 Embryonen, und markieren Sie die Zeit auf gesammelten den Deckel von jedem Gericht.
- Sobald die Fische begonnen haben über, bereiten wir frische Injektionslösung durch Mischen der folgenden in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis:
Komponente Transposon-Plasmid Lager (125ng/μl) 1μl Transposase RNA Lager (175ng/μl) 1μl Phenolrot Lager (2% in H 2 O) 0.5μl RNase freies Wasser 2.5μl
Die Injektionsnadeln sind in Besitz Gerichte gelegt und gefüllt mit einer Pipette 500 nl Tropfen Injektionslösung auf das breite Ende jeder Nadel. Nachdem die Flüssigkeit an der Spitze durch Kapillarwirkung ist, können zusätzliche Lösung zu insgesamt von 1,5-2 ul hinzugefügt werden. Wir bereiten mindestens zwei Nadeln für jede Injektion Lösung. - Der gefüllte Nadel in der Hand gehalten Nadelhalter einer pneumatischen Pico-Pump-oder ähnlichen Druck-Injektor, konfiguriert und mit einem N2-Tank Anweisungen des Herstellers geladen werden. Wir kalibrieren Injektionsvolumina durch Messung des Durchmessers der Tröpfchen in Mineralöl auf einem Mikrometer schieben vertrieben. Typischerweise wird eine Injektion von 120 ms mit einem Druck von 20 psi Ertrag eines Tropfens von etwa 1 nl, aber leichte Variationen in Nadeldurchmesser werden diese Parameter beeinflussen und Neukalibrierung kann zwischen Nadeln erforderlich.
- Die Injektionen werden unter einem Stereomikroskop bei 6-10-facher Vergrößerung durchgeführt. Wir verwenden ein Paar feine Pinzette auf den Embryo in Position zu halten, drücken Sie die Injektionsnadel mit gleichmäßigem Druck durch die Chorion und in den Dotter eines Embryos in der einen Zelle oder Anfang zwei Zellen der Bühne. Idealerweise positionieren wir die Nadelspitze in den Dotter knapp unterhalb der Blastomeren. Etwa 1 nl Injektionslösung ist ausgeschlossen und die Nadel zurückgezogen. Für jedes Konstrukt spritzen wir ≥ 200 Embryonen. Es ist auch sehr wichtig, für jede Kupplung von Embryonen gesammelt, um eine Schüssel mit injizierten Kontrolle Embryonen zu retten.
- Nach Injektionen abgeschlossen sind sortieren wir die Embryonen, die durch das Entfernen unbefruchteten Eiern, Embryonen geschädigt, und scheiterte Injektionen (Embryonen ohne Phenolrot in Blastomeren). Wir haben dann inkubieren die Embryonen in Embryo Medium bei 28,5 ° C, bis die geeignete Zeit für Beobachtungen.
3. Die Analyse der Mosaik-Expressionsmuster
- Nach einer geeigneten Inkubationszeit, untersuchen wir die injizierten Embryonen für die Fluoreszenz. Der Zeitpunkt hängt von der normalen Expressionsmuster des endogenen Zebrafisch-Gen, aber wir sehen in der Regel durch die ersten 5 Tage nach der Befruchtung täglich.
- Wir untersuchen die Embryonen für die Fluoreszenz auf einer Olympus MVX10 Makroskop für Epifluoreszenz ausgestattet, aber eine ähnliche Mikroskop in der Lage Low-Power-Bildgebung arbeiten. Wenn es eine große Zahl von Embryonen, die starben oder entwickelt ungewöhnlich in den ersten Tag sind bei der injizierten Kontrollen für die Kupplung, um zu sehen, wenn sie normal aussehen. Wenn die Kontrollen normalen aussehen, ist das häufigste Problem unzureichender Reinheit der injizierten DNA. Auch werden die Embryonen in einem frühen Stadium empfindlich auf die Gesamtmenge des injizierten Plasmid, so ist es möglich, dass die Quantifizierung ungenau war und zu viel DNA injiziert wurde.
- Bei der Untersuchung der Embryonen im Hinterkopf behalten, dass sie alle Mosaik für die injizierten konstruieren. Es wird notwendig sein, um sorgfältig zu prüfen alle Embryonen, vor allem, wenn die erwartete Domäne des Ausdrucks klein ist. Denken Sie auch daran, dass der Ausdruck könnte dynamische, starke Fluoreszenz an Tag 1 könnte für Tag 2 und Embryonen negativ für die Expression der ersten 3 Tage vielleicht etwas an Tag 4 zeigen verschwinden.
- Wir wählen einige Embryonen mit umfangreicher Ausdruck, und diese nutzen, um das Muster der Fluoreszenz durch photomicroscopy Dokument. Nach 5 Tagen von Beobachtungen, sollten die Embryonen in die Anlage zurückgeführt werden und aufgewachsen als Lager. In einigen Monaten, können die Erwachsenen für Keimbahn Übertragung der Transgene zu sehen sein.
4. Ergebnisse
Wir sehen eine große variety von Mustern und Ebenen des Ausdrucks, abhängig von der Enhancer-Element analysiert. Wir sind in der Regel daran interessiert, sehr gewebespezifische Expressionsmuster und sind oft mit Schwerpunkt auf Gene in das Skelett zum Ausdruck gebracht. und sind oft mit Schwerpunkt auf Gene in das Skelett zum Ausdruck gebracht. Abbildung 2 zeigt Beispiele von Mosaik Expressionsmuster wir in unserer injizierten Embryonen beobachtet haben, mit Enhancer Regulation der Expression in Knorpel und Knochen. Schließlich machen einen erheblichen Teil der untersuchten Sequenzen nicht regulieren gewebespezifische Expression. Für diese haben wir am häufigsten sehen, nur sehr wenig Fluoreszenz, vielleicht ein paar verstreute Zellen pro Embryo. Weniger häufig, vielleicht sehen wir Fluoreszenz, sondern nur in zwei gemeinsamen Seiten für ektopische Expression, der Epidermis und der Skelettmuskulatur (Abbildung 3). 
Abbildung 2. Beispiel von Knorpel und Knochen Expressionsmuster in injizierten Embryonen beobachtet. 
Abbildung 3. Es gibt kaum eine Korrelation zwischen Lage der Enhancer in Bezug auf die Gen-und Regulation der Expression. Ein wesentlicher Teil der getesteten Sequenzen nicht regeln gewebespezifische Expression. Diese haben oft sehr wenig Fluoreszenz, oder zwei gemeinsame Standorte für ektopische Expression haben: der Epidermis und der Skelettmuskulatur. (Top) Hellfeldaufnahme (Bottom) GFP-Fluoreszenz Bild.
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Discussion
Wir haben den Ansatz in unserem Labor für die effiziente Analyse potentieller Enhancer mit Zebrafisch Transgenese verwendet demonstriert. Meistens benutzen wir diesen Ansatz für Gewebe-spezifische Enhancer mit menschlichen Genen assoziiert zu suchen. Trotz des Fehlens von klar Sequenzhomologie die meiste Zeit zwischen Mensch und Fisch nicht-kodierenden Sequenzen, finden wir, dass dieser Ansatz ist in der Regel bei der Identifizierung von Mitteln für die Gene von Interesse, um uns erfolgreich. Die kritischen Faktoren für den Erfolg sind die Betreuung bei der Vorbereitung der Plasmid-DNA und der RNA-Transposase, und die Injektion und die Prüfung einer ausreichenden Zahl von Embryonen, die für jedes Konstrukt. Die allgemeinen Methoden der Transgen Bau-, Embryo microinjections und Mosaik Expressions-Analyse wäre für transgenen Zebrafisch-Linien für viele andere Zwecke erzeugt.
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Acknowledgments
Wir danken Frau Paula Roy für exzellente Fisch Tierhaltung und Steve Ekker für die Art Geschenk der pDB600 Plasmid. Diese Studien wurden durch einen Zuschuss zur SF aus NHGRI finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
