Summary
我们证明我们的方法来寻找潜在发育调控基因的增强子元件和评估它们的功能，通过镶嵌的斑马鱼转基因。
Abstract
人类基因组序列的完成，以及其他许多物种，突出了把特定功能的非编码序列的挑战。由非编码的基因组的一部分进行的一个突出功能是调节基因的转录;但是，有没有有效的方法来大致预测的主要DNA序列的顺式调控元件。我们已经开发出一种高效的协议功能评估潜在的顺式调控，通过斑马鱼转基因的元素。我们的方法提供了发育的重要基因的细胞培养为基础的技术，显着的优势，因为它提供信息的空间和时间的基因调控。相反，它是更快和更昂贵的比类似的实验，在转基因小鼠，我们经常将其应用到人类基因组序列。在这里，我们证明我们的方法来测试序列克隆序列的养护和我们的协议的基础上，显微注射到斑马鱼的胚胎中选择元素。
Protocol
1。选型和测试的保守序列的克隆
- 首先必须找出潜在的调控序列进行功能测试。我们依赖于进化的序列保守性作为标准来选择序列，最经常使用的算法PhastCons，这是作为跟踪UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）访问。然而，还有许多其他可用来评估跨物种的序列保守的算法。
- 一旦我们选择了我们的序列，设计引物扩增基因组DNA的每个序列。应选择引物扩增保守的区域再加上30个或更多的碱基对任何一方。
- 对于选定的序列的扩增，我们使用的宝LA TaqTM系统。其他聚合酶的工作，但重要的是要使用的混合，其中包括一个与校对能力的酶，以减少放大过程中引入的错误的机会。我们核实琼脂糖凝胶电泳扩增大小。
- 我们使用的PCR 8/GW/TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen）的克隆到一个条目含有attL重组位点的载体的PCR产物，生成的网关条目克隆。克隆反应是新鲜的PCR产物更有效率，所以最好是一天的PCR克隆内执行。 DH5α菌株的转化是由奇霉素抗性选择。
- 我们验证TA克隆的产物〜500ng的质粒用EcoRI消化释放插入，并确认的琼脂糖凝胶电泳插入的大小。我们建议测序验证插入的顺序和方向，也可用于测序引物扩增。
- 从入门克隆的保守序列，非编码穿梭LR的重组，我们的网关的准备目标向量，pGW_cfosGFP1，使用网关LR Clonase II酶混合物（Invitrogen公司）。 DH5α菌株的转化是通过氨苄青霉素抗性选择。
- 我们产品的LR重组核实消化〜500ng的质粒与EcoRV释放插入，并确认的琼脂糖凝胶电泳插入的大小。一旦已确定一个准确的克隆，我们准备了质粒DNA使用Qiagen公司HiSpeed ®质粒MIDI套件。我们进一步纯化的质粒用QIAquick PCR纯化试剂盒，根据制造商的协议，并与30μLRNase的自由水洗脱的DNA。质粒是稀释浓度为125纳克/μL，并保存在4 ° C前注射。
- 从pDB600 plasmid2 体外转录的RNA编码功能Tol2转座酶。我们净化使用Qiagen公司的Midi - PREP试剂盒的质粒，然后用XbaI线性10-20微克。 mRNA的合成进行了以下mMESSAGE mMACHINE包协议（Ambion公司）。
- 我们净化和沉淀的RNA按试剂盒说明书。我们悬浮RNA的〜1μg/μl终浓度，或20μL一个反应，在核糖核酸酶自由水，紫外分光光度法和量化。我们还分析了〜琼脂糖凝胶电泳的RNA1μg验证全长转录。虽然标准的TAE或TBE凝胶是足够的，这种分析，转录试剂盒中包含的变性样品缓冲液应使用按试剂盒说明书。
- 我们测试的功效，与已知的质粒（图1）执行注射每一批新的转座RNA。经核实，RNA分成小等分，并保存于-80 ° C，以避免反复解冻和重新冻结个人等份。
图1。斑马鱼胚胎注射用鼠标SOX10增强剂控制（上）明场（ 下 ）GFP荧光图像。每一批新的转座RNA是对疗效进行测试。
2。斑马鱼的胚胎显微注射马赛克转基因分析
- 我们从1.2毫米外径长丝在萨特的P - 97微管牵引器的毛细管玻璃拉显微注射针，程序设计，产生一个具有相当尖锐的锥形完整的chorions渗透强烈的提示。我们打破立体显微镜下手工技巧，外直径约15微米，使用干净的刀片和微米幻灯片。针，可一天前注射，并储存在有盖的控股菜要保持清洁。
- 我们保持定期的光线暗的周期我们的斑马鱼，有14小时的光照，根据标准conditions3。前一天表演microinjections，我们成立了定时交配繁殖小坦克，每一个基槽组成，开槽插入，和一个塑料盖鱼。我们把三女两男每吨在并行行ANK。
- 在上午的microinjections，光周期开始后不久，我们开始在干净的系统处理过的水相结合的鸡蛋生产的男性和女性。重要的是经常检查鱼，并奠定了几分钟内收集的鸡蛋，以及同步批次。蛋产量可维持两到三个小时，继续结合整个上午的新鲜的鱼群体。
- 一个大口径，5 1 / 4“装有一个乳胶灯泡玻璃巴斯德吸管，我们排序为60 × 15毫米培养皿部分充满胚胎中2，在50个胚胎组，收集胚胎，并标记时间收集每道菜的盖子。
- 一旦鱼已经开始铺设，我们准备了新鲜的注射液在离心管上冰混合以下：
组件 转座子质粒股票（125ng/μl） 加入1μl 转座子RNA股票（175ng/μl） 加入1μl 酚红股（H 2 O 2％） 0.5μL 核糖核酸酶自由水 2.5μl
在控股菜奠定注射针头和充满吹打到广角端的是每个针注射液500 NL滴。后的液体通过毛细作用的提示，可以添加额外的解决方案共1.5-2μL。我们准备至少有两个针头每次注射液。 - 充满针装入手持针气动的Pico -泵或类似的高压注射器，配置并连接到每个制造商的指示的氮气罐，人。我们通过测量微米幻灯片上驱逐到矿物油的液滴直径校准注入量。通常情况下，用20磅的压力的注射时间为120毫秒，将产生约1 NL液滴，但针直径的微小变化会影响这些参数之间的针头可能需要重新校准。
- 6 - 10X放大倍率的体视显微镜下进行注射。我们使用了一双细镊子举行的地方胚胎，推动通过蛋壳和稳定的压力到一个单元或两个细胞阶段的早期胚胎在蛋黄注射针头。理想的情况下，我们的地位在针尖蛋黄正下方的卵裂球。约1 NL注射液被驱逐和针撤回。对于每一个构造我们注入≥200胚胎。这也是非常重要的，每个收集胚胎离合器，一碟uninjected控制胚胎保存。
- 注射完成后，我们通过清除未受精卵，胚胎受损，未能注射胚胎在卵裂球酚红没有排序胚胎。然后，我们在28.5 ° C，直到适当的时候观测孵化胚胎培养基中的胚胎。
3。马赛克表达模式分析
- 经过适当的培养时间，我们研究荧光注入胚胎。时间取决于内源性的斑马鱼基因的正常表达模式，但通常我们期待通过受精后第5天每天。
- 我们研究epifluorescence装奥林巴斯MVX10 macroscope荧光的胚胎，但任何类似显微镜的低功耗成像能力的工作。如果有大量的胚胎死亡，或在第一天的异常发达，看看uninjected离合器的控制，看看他们看起来正常。如果控件的外观正常，最常见的问题是注入的DNA的成色不足。此外，在早期阶段的胚胎注入质粒总额敏感，所以它是可能的，是不准确的量化和太多的DNA注入。
- 研究胚胎时，请记住，他们都将镶嵌注入的构造。仔细看所有的胚胎将有必要的，特别是如果预计域表达小。还记得的表达，可以动态;较强的荧光，第1天，第2天，胚胎负，第3天表达可能会显示第4天的东西可能会消失。
- 我们选择一些更广泛的表达胚胎，并使用这些文件通过光学显微镜，荧光模式。经过5天的观察，胚胎，应返回到工厂的股票筹集的。在数月内，成年人可以进行筛选，生殖细胞传播的转基因。
4。结果
我们看到一个宽Variety模式和表达水平，取决于被分析的增强子元件。我们通常是在非常的组织特异性表达模式感兴趣，而且往往集中在骨架基因表达。往往集中在骨架基因表达。图2显示了马赛克表达模式与调节软骨和骨中的表达增强剂的例子，我们观察到，在我们注射的胚胎。最后，测试序列的很大一部分不规范组织的具体体现。对于这些，我们最常看到的非常小的荧光，也许数每胚胎细胞散。减的时候，我们可能会看到荧光，但只有在两种常见的部位为异位表达，表皮和骨骼肌肉（图3）。 
图2。在注射胚胎中观察到的软骨和骨的表达模式的例子。 
图3。有增强基因表达调控的相对位置之间的关联度不大。一个测试序列的很大一部分不规范的组织特异性表达。这些通常只有很少的荧光，或可能有两个常见的部位为异位表达：表皮和骨骼肌。 （上）明视图像（ 下 ）GFP的荧光图像。
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Discussion
我们已经证明，在我们的实验室用于潜在的增强剂使用斑马鱼转基因的高效分析方法。大多数情况下，我们使用这种方法，寻找与人类基因相关的组织特异性的增强剂。尽管缺乏明显的序列同源性之间的人类和鱼类非编码序列，我们发现，这种方法通常是在成功地确定我们感兴趣的基因的增强剂。成功的关键因素，正在编制的质粒DNA和RNA的转座护理，注射和检查每个构造足够数量的胚胎。转基因工程，胚胎microinjections，并镶嵌表达分析的一般方法，将适用于产生许多其他用途的转基因斑马鱼线。
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Acknowledgments
我们感谢女士出色的鱼牧保罗伊，史蒂夫Ekker pDB600质粒礼物。这些研究是由来自NHGRI批到SF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
