Summary
Nós demonstramos a nossa abordagem para encontrar elementos potenciais potenciador de genes regulados developmentally e avaliar a sua função através de transgênese zebrafish mosaico.
Abstract
A conclusão da seqüência do genoma humano, juntamente com a de muitas outras espécies, destacou o desafio de atribuir função específica a não seqüências de codificação. Uma função de destaque realizadas pela fração não-codificante do genoma é regular a transcrição de genes, no entanto, não existem métodos eficazes para prever amplamente cis-regulatórias elementos de seqüência de DNA primária. Nós desenvolvemos um protocolo eficiente para avaliar o potencial funcional cis-regulatórias elementos através de transgênese zebrafish. Nossa abordagem oferece vantagens significativas sobre cultura de células-técnicas baseadas em genes developmentally importante, pois fornece informações sobre regulação do gene espacial e temporal. Por outro lado, é mais rápido e menos dispendioso do que experimentos semelhantes em camundongos transgênicos, e nós rotineiramente aplicá-la a seqüências isoladas do genoma humano. Aqui demonstramos nossa abordagem para selecionar elementos para o teste com base na conservação de seqüência e nosso protocolo para seqüências de clonagem e microinjecting-los em embriões de peixe-zebra.
Protocol
1. Seleção e clonagem de sequências conservadas para testes
- É preciso primeiro identificar potenciais seqüências regulatórias para testes funcionais. Contamos com a conservação da sequência evolutiva como critério para selecionar as seqüências, e na maioria das vezes usar o PhastCons algoritmo, que é acessível como uma faixa no navegador Genoma UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). No entanto, existem muitos outros algoritmos disponíveis para avaliar a conservação de seqüência entre as espécies.
- Uma vez selecionado o nosso seqüências, podemos projetar primers para amplificar cada seqüência de DNA genômico. Primers devem ser selecionados para amplificar a região conservada mais 30 ou mais pares de base em ambos os lados.
- Para amplificação das seqüências selecionadas usamos o sistema de Takara LA TaqTM. Polimerases outro vai funcionar, mas é importante usar um mix que inclui uma enzima com capacidade de revisão, para minimizar as chances de erros introduzidos durante a amplificação. Nós verificar o tamanho amplicon por eletroforese em gel de agarose.
- Usamos o pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) para clonar o produto da PCR em um vetor de entrada contendo locais de recombinação Attl, para gerar o clone entrada Gateway. A reação de clonagem é mais eficiente com produtos de PCR fresco, por isso é melhor para realizar a clonagem em um dia da PCR. Transformação em linhagens DH5α é realizada seguido por espectinomicina seleção de resistência.
- Nós verificamos o produto da clonagem TA por digestão de ~ 500ng de plasmídeo com EcoRI para liberar a inserir e confirmar o tamanho da pastilha por eletroforese em gel de agarose. Recomendamos seqüenciamento para verificar a seqüência de inserção e orientação; primers utilizados para amplificação também pode ser utilizado para o seqüenciamento.
- Do clone de entrada, a seqüência não-codificante é conservada empurrados por recombinação LR para o nosso vector de destino gateway pronto, pGW_cfosGFP1, usando gateway LR Clonase II enzima Mix (Invitrogen). Transformação em linhagens DH5α é realizado seguido de ampicilina seleção de resistência.
- Nós verificamos o produto da recombinação LR por digestão de ~ 500ng de plasmídeo com EcoRV para liberar a inserir e confirmar o tamanho da pastilha por eletroforese em gel de agarose. Uma vez que um clone exato foi identificado, nos preparamos DNA plasmídeo usando o HiSpeed Qiagen ® Kit Midi Plasmid. Nós purificar ainda mais o plasmídeo utilizando o Kit de Purificação QIAquick PCR, de acordo com protocolos do fabricante, e eluir o DNA com 30 mL de água livre de RNase. O plasmídeo é diluída a uma concentração de 125 ng / mL e armazenado a 4 ° C antes de injeções.
- RNA codificação funcional Tol2 enzima transposase é transcrito in vitro da pDB600 plasmid2. Purificamos o plasmídeo usando o kit Qiagen Midi-Prep, então linearizar 10-20 mg com XbaI. A síntese de mRNA é realizada após a mMACHINE mMESSAGE Kit protocolo (Ambion).
- Nós purificar e precipitar o RNA de acordo com instruções do kit. Nós ressuspender RNA para uma concentração final de ~ 1μg/μl, ou 20 l para uma reação única, em água livre de RNase, e quantificar por espectrofotometria de UV. Também analisamos ~ 1μg de RNA por eletroforese em gel de agarose para verificar a transcrição de corpo inteiro. Embora uma TAE padrão ou gel TBE é adequada para esta análise, o tampão de amostra desnaturante incluído com o kit de transcrição deve ser usado de acordo com instruções do kit.
- Testamos cada novo lote de transposase RNA para a eficácia através da realização de injeções com uma conhecida (Figura 1) plasmídeo. Após a verificação, o RNA é dividida em pequenas alíquotas e armazenadas a -80 ° C, para evitar o descongelamento e recongelamento repetido de alíquotas individuais.
Figura 1. Embrião do zebrafish injetado com o rato SOX10 enhancer como controle. (Top) Brightfield imagem (Bottom) GFP imagem de fluorescência. Cada novo lote de transposase RNA é testado para sua eficácia.
2. Microinjeção de embriões zebrafish para análise mosaico transgênicos
- Puxamos as agulhas para a microinjeção de 1,2 milímetros de vidro de filamentos de OD capilar em um P-97 Sutter Puller Micropipeta, com um programa projetado para produzir uma dica forte com uma vela bastante acentuada para penetrar córions intacta. Nós quebramos as pontas com a mão sob um estereomicroscópio para um diâmetro exterior de cerca de 15 mm, usando uma lâmina limpa e um micrómetro. As agulhas podem ser feitas no dia anterior injeções, e armazenado em um prato coberto holding de manter limpo.
- Mantemos o nosso peixe-zebra em um ciclo de luz regular escuro, com 14 horas de luz, sob conditions3 padrão. Dia anterior à realização de microinjeções, montamos peixe para acasalamentos cronometrado em tanques de criação de pequeno porte, cada uma composta por um tanque de base, uma inserção de fenda, e uma tampa de plástico. Colocamos três mulheres ou dois homens por tank em fileiras paralelas.
- Na manhã do microinjeções, logo após o ciclo de luz começa, começamos a combinar machos e fêmeas no sistema de água tratada potável para produção de ovos. É importante verificar o peixe com frequência, e recolher os ovos dentro de alguns minutos de postura, para obter lotes bem sincronizados. Produção de ovos pode ser mantido por duas a três horas, continuando a combinar grupos de peixe fresco durante a manhã.
- Com furo de largura, 5 1 / 4 "de vidro Pasteur pipeta equipado com uma lâmpada de látex, que classificar os embriões colhidos em 60 x 15 milímetros pratos Petri, parcialmente cheio de Embrião Medium2, em grupos de 50 embriões, e marcar o tempo recolhidos em a tampa de cada prato.
- Uma vez que os peixes começaram a postura, nós preparamos solução nova injecção, misturando o seguinte em um tubo de microcentrífuga no gelo:
Componente Transposon estoque plasmídeo (125ng/μl) 1μl Transposase RNA ações (175ng/μl) 1μl Estoque de vermelho de fenol (2% em H 2 O) 0.5μl RNase água livre 2.5μl
As agulhas de injeção são colocados em segurando pratos e preenchido por pipetagem 500 gotas nl de solução de injeção para a grande final de cada agulha. Depois o líquido é atraído para a ponta por acção capilar, a solução adicionais podem ser adicionados a um total de 1,5-2 mL. Nos preparamos, pelo menos, duas agulhas de injeção para cada solução. - A agulha cheia é carregado na mão agulha titular de um pneumático Pico bomba-injector de pressão ou similar, configurado e conectado a um tanque de N2 por instruções do fabricante. Nós calibrar volumes de injeção, medindo o diâmetro de gotículas expelidas em óleo mineral em um micrómetro. Tipicamente, um tempo de injeção de 120 ms com uma pressão de 20 psi dará uma gota de aproximadamente 1 nl, mas pequenas variações na agulha de diâmetro vai afetar esses parâmetros e recalibração pode ser requerido entre as agulhas.
- As injeções são realizadas sob um estereomicroscópio com 6-10X ampliação. Nós usamos uma pinça fina para segurar o embrião no lugar, empurre a agulha de injeção com pressão constante através do córion e na gema de um embrião no estágio uma célula ou células início dois. Idealmente, nós a posição da ponta da agulha na gema, logo abaixo do blastômeros. Aproximadamente 1 nl de solução injectável é expulso ea agulha retirada. Para cada construção injetamos ≥ 200 embriões. É também muito importante, para cada ninhada de embriões colhidos, para salvar um prato de embriões controle uninjected.
- Após as injeções são concluídos, podemos classificar os embriões através da remoção de ovos não fertilizados, embriões danificados, e injeções falhou (embriões sem vermelho de fenol em blastômeros). Em seguida, incubar os embriões em meio de embriões em 28.5 ° C até o momento adequado para observações.
3. Análise de padrões de expressão mosaico
- Após um tempo de incubação apropriado, examinamos os embriões injetados para fluorescência. O tempo depende do padrão de expressão normal do gene endógeno zebrafish, mas geralmente procuram diariamente através da primeira fertilização pós 5 dias.
- Examinamos os embriões para fluorescência em um macroscópio MVX10 Olympus equipado para epifluorescência, mas qualquer microscópio semelhante capaz de imagem de baixa potência vai funcionar. Se houver um grande número de embriões que morreram ou desenvolveram de forma anormal no primeiro dia, olhar para os controles uninjected para essa embreagem para ver se eles parecem normais. Se os controles de aparência normal, o problema mais comum é a pureza insuficiente do DNA injetado. Além disso, os embriões em estágios iniciais são sensíveis à quantidade total de plasmídeo injetado, por isso, é possível que a quantificação foi impreciso e muito DNA foi injetado.
- Ao examinar os embriões, tenha em mente que todos eles vão ser mosaico para a construção injetado. Será necessário analisar cuidadosamente todos os embriões, especialmente se o domínio esperado de expressão é pequena. Lembre-se também que a expressão poderia ser dinâmico; fluorescência forte no dia 1 pode desaparecer até dia 2, e os embriões negativos para a expressão dos 3 primeiros dias pode mostrar algo no dia 4.
- Nós escolhemos alguns embriões com expressão mais ampla, e usá-las para documentar o padrão de fluorescência por fotomicroscópio. Após cinco dias de observações, os embriões devem ser devolvidos à facilidade e levantou como um estoque. Em vários meses, os adultos podem ser rastreados para a transmissão de células germinativas dos transgenes.
4. Resultados
Vemos uma ampla variety de padrões e níveis de expressão, dependendo do elemento potenciador sendo analisado. Estamos muito interessados em geral tecidos padrões de expressão específica, e muitas vezes são focando genes expressos no esqueleto. e são frequentemente focando genes expressos no esqueleto. A Figura 2 mostra exemplos de padrões de expressão mosaico que temos observado em nosso embriões injetados, com enhancers regulação da expressão de cartilagem e osso. Finalmente, uma parte substancial das seqüências testadas não regulam a expressão tecido específico. Para estes, que mais frequentemente ver fluorescência muito pouco, talvez apenas algumas células por embrião. Menos freqüentemente, podemos ver de fluorescência, mas apenas em dois locais comuns para a expressão ectópica, a epiderme e músculo esquelético (Figura 3). 
Figura 2. Exemplo de padrões de cartilagem e osso expressão observada em embriões injetados. 
Figura 3. Há pouca correlação entre a localização do parente enhancer do gene e regulação da expressão. Uma parte substancial das seqüências testadas não regulam a expressão tecido específico. Estes muitas vezes têm de fluorescência muito pouco, ou pode ter dois locais comuns para a expressão ectópica: a epiderme e músculo esquelético. (Top) imagem Brightfield (Bottom) GFP imagem de fluorescência.
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Discussion
Nós demonstramos a abordagem utilizada em nosso laboratório para a análise eficiente de enhancers potencial usando transgênese zebrafish. Na maioria das vezes, usamos esta abordagem de olhar para o tecido-específicas enhancers associados com os genes humanos. Apesar da falta de homologia de seqüência mais óbvia do tempo entre humanos e peixes sequências não codificantes, descobrimos que esta abordagem é geralmente bem sucedido em identificar potenciadores para os genes de interesse para nós. Os fatores críticos para o sucesso estão cuidando da preparação do DNA plasmidial e do RNA transposase, e injetando e examinando um número suficiente de embriões para cada construto. Os métodos gerais de construção transgene, microinjeções de embriões, e análise de expressão mosaico seria aplicável para a geração de linhas de zebrafish transgênicos para muitos outros fins.
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Acknowledgments
Agradecemos a Sra. Paula Roy para criação de peixe excelente, e Steve Ekker para o presente amável do plasmídeo pDB600. Estes estudos foram financiados por uma doação para SF de NHGRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Takara LA Taq | Takara Bio Inc | RR02M | |
| pCR8/GW/TOPO TA Cloning Kit | Invitrogen | K2500-20 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme Mix | Invitrogen | 11791-100 | |
| Library efficiency competent cells DH5α | Invitrogen | 12535-019 | |
| Library efficiency competent cells DB3.1 | Invitrogen | 11782-018 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1340 | |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 |
References
- Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
- Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).
- The Zebrafish Book. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).
