Summary
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.
Abstract
Neutrophile Granulozyten sind die häufigsten Gruppe von Leukozyten in das periphere Blut. Als professionelle Phagozyten, sie zu verschlingen Bakterien und töten sie intrazellulär, wenn ihre antimikrobielle Granula verschmelzen mit dem Phagosom. Wir fanden, dass Neutrophile eine zusätzliche Möglichkeit der Abtötung von Mikroorganismen haben: bei Aktivierung, geben sie Granulat Proteine und Chromatin, die zusammen extrazelluläre Fasern binden Krankheitserreger. Diese neuartigen Strukturen oder Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degradieren Virulenzfaktoren und töten Bakterien 1, 2 und Pilze Parasiten 3. Die strukturelle Rückgrat der NETs ist die DNA, und sie sind schnell abgebaut in Gegenwart von DNasen. So sind Bakterien exprimiert DNasen virulenter 4. Mit korrelative Mikroskopie kombiniert TEM, SEM, Immunfluoreszenz und Live Cell Imaging Verfahren konnten wir zeigen, dass nach Stimulation, die Kerne der Neutrophilen ihre Form verlieren und die EU-und Heterochromatin zu homogenisieren. Später zerfallen die Kernhülle und das Granulat Membranen ermöglicht das Mischen von NET-Komponenten. Schließlich werden die NETs als die Zellmembran Pausen freigegeben. Das Zelltod-Programm (NETosis) unterscheidet sich von Apoptose und Nekrose und hängt von der Generation von reaktiven Sauerstoffspezies durch NADPH-Oxidase-5.
Neutrophile extrazelluläre Fallen sind reichlich an den Standorten der akuten Entzündung. NETs scheint eine Form der angeborenen Immunantwort sein, dass zu binden Mikroorganismen, Verhütung ihrer Ausbreitung, und sorgen für eine hohe lokale Konzentration von antimikrobiellen Wirkstoffen zu Virulenzfaktoren erniedrigen und töten Krankheitserreger so dass Neutrophile auf ihre antimikrobielle Funktion auch über ihre Lebensdauer zu erfüllen. Es gibt zunehmend Hinweise, jedoch, dass die NETs auch in Krankheiten, die beteiligten reichen von Autoimmunsyndrome zu Unfruchtbarkeit 6.
Wir beschreiben Methoden zur neutrophilen Granulozyten aus peripherem menschlichem Blut 7 zu isolieren und sie dazu anregen NETs zu bilden. Auch wir sind Protokolle, um die Netze in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.
Protocol
1. PMN Isolation aus menschlichem Blut
Verwenden Sie ca. 24 ml menschliches Blut mit EDTA oder Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans.
- Add 6 ml Histopaque 1119 bis ein 15 ml Falcon-Röhrchen und sorgfältig Schicht von 5 bis 7 ml Vollblut an der Spitze.
- Zentrifuge für 20 Minuten bei 800 xg ohne Bremse.
- Absaugen und entsorgen gelblich und klar oberste Schicht und Transfer untere rötliche Phase mit Granulozyten in frischen Falcon-Röhrchen.
- Wash-Zellen durch Auffüllen Falcon-Röhrchen mit PBS und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g.
- In der Zwischenzeit bereiten eine 100% ige Percoll-Lösung durch Mischen 18 ml Percoll mit 2 ml 10x PBS. Mit 1x PBS vorzubereiten 4 ml Lösungen von 85%, 80%, 75%, 70% und 65% Percoll.
- Bereiten Sie 2 Falcon Röhrchen mit einem Percoll-Gradienten durch die Schichtung von 2 ml jeder Prozentpunkt auf der jeweils anderen in absteigender Reihenfolge.
- Nach der Zentrifugation den Überstand, kombinieren Pellets und resuspendieren sedimentierten Zellen in 4 ml PBS.
- Sorgfältig Layer 2 ml der Resuspension auf jede der Steigungen.
- Zentrifuge für 20 Minuten bei 800 xg ohne Bremse.
- Nach der Zentrifugation zu entfernen oberste Schicht und die meisten der 65%-Schicht mit PBMCs und sammeln weißen verbleibenden Interphase bis 85%-Schicht in neue Falcon-Röhrchen.
- Wash-Zellen durch Auffüllen der Falcon-Röhrchen mit PBS und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g.
- Entfernen Überstand und resuspendieren sedimentierten Zellen (in der Regel> 95% sind PMN) in 2 ml PBS.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
2. Aktivieren PMNs
- Bereiten Sie eine 24-well Zellkulturplatte, indem eine sterile 13 mm runden Deckglas (# 1,5) in jedes Well
- Seed 2 x 10 5 Zellen in 500μl RPMI (mit 2% humanem Serum Albumin) pro Well und Inkubation für 1 Stunde in CO 2-Inkubator bei 37 ° C.
- In der Zwischenzeit bereiten 600 nM PMA-Lösung in RPMI und fügen die Zellen 100 &mgr; pro Vertiefung. Inkubieren von 15 min bis 4 h in CO 2-Inkubator bei 37 ° C.
- Fix-Zellen in 4% (Endkonzentration) Paraformaldehyd in PBS gelöst.
PMA dient als positive Kontrolle und ist bis heute die stärkste Agent NET zu induzieren. Alternativ können auch andere Reize oder die Co-Kultivierung mit Krankheitserregern für NET Induktion verwendet werden.
Der jeweilige Status der NET-Bildung kann überprüft während der Zeit natürlich verläuft, wenn zusätzliche parallele Proben vorbereitet werden. Wenn ein Nicht-Permeationsmittel DNA-Farbstoff wie Sytox Green (Invitrogen), die nicht fixierten Zellen aufgenommen wird, werden nur extrazelluläre DNA nachgewiesen werden. Seit der Gründung von neuen NETs ist irgendwie in der Gegenwart von Sytox beeinträchtigt, für jeden Zeitpunkt eine parallele Probe verwendet werden.
3. NET-Erkennung durch Immunomarkierung
NETs sind sehr zerbrechlich, auch nach der Fixierung und müssen mit großer Vorsicht behandelt werden, sonst wird die Mehrheit bei der Vorbereitung zu verlieren.
- Entfernen Sie vorsichtig Glasdeckgläschen mit anhaftenden Zellen aus 24-well Platte, indem Sie ihn bis an den Rand mit einer gebogenen Nadel und nutzen sie mit einer feinen Pinzette. Legen Sie das Deckglas umgekehrt auf einen Tropfen PBS. Dies kann auf einer Parafilm Blatt für ein Reagenzglas stand durchgeführt werden. Wash wie dieses 3-mal für 5 min.
- Inkubieren Deckgläser auf die gleiche Weise in einem Rückgang von 0,5% Triton X-100 für 1 min bei RT Zellen permeabilisieren zu. Wash 3 mal in PBS für 1 min.
- Bereiten Sie eine feuchte Kammer mit Parafilm und einem feuchten Tuch. Legen Sie das Deckgläschen kopfüber auf einen Tropfen Blockierungspuffer (5% Esel-Serum) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Verdünnen Primärantikörper, zB ms anti Histon und rb anti Neutrophile Elastase, in Blocking-Puffer.
- Transfer Deckgläser in der feuchten Kammer direkt aus Blockierungspuffer auf einen Rückgang des primären Antikörpers und Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
- 3 x je 5 min mit PBS.
- Verdünnen Sekundärantikörper, zB dk anti ms Cy2 und dk anti rb Cy3, in Blocking-Puffer.
- Transfer Deckgläser in die feuchte Kammer auf einen Rückgang des sekundären Antikörper und Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
- 3 x je 5 min mit PBS. Abhängig von Ihrer Fluoreszenzmikroskopie Optionen Fleck DNA für 5 min entweder mit Hoechst 33342 (1 pg / ml), die UV-Anregung oder mit Draq5 für weit roten Anregung benötigen und waschen zweimal mit dest. Wasser.
- Setzen Sie einen 20 &mgr; l Tropfen Mowiol auf einen Objektträger und montieren Deckgläser mit Zellen auf den Kopf. Die Zellen müssen zwischen dem Deckglas und dem Objektträger werden. Die Tropfen Mowiol bilden eine dünne Schicht von homogenen Dicke, wenn das Deckglas auf den Tropfen positioniert ist. Normalerweise ist es nicht erforderlich, um die Probe zu drücken. Wenn Sie nicht Immersionslinsen verwenden möchten, wird die Probe zur Inspektion bereit.Für mikroskopische Analyse mit Immersionslinsen, lassen Sie die Probe trocken für etwa 1 Stunde, bis die Mowiol am Rand der Probe erstarrt ist.
4. Vorbereitung NETs für Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
- Beitrag fix Zellen auf der Glasdeckgläschen in 24-Well-Platte mit 2,5% Glutaraldehyd.
- Entfernen Glasdeckgläschen enthält Zellen, die aus 24-well Platten und legte den Kopf auf einen Tropfen Wasser. Wash wie dieses 3-mal für 5 min.
- Transfer Deckgläschen wieder in 24-well Zellkulturplatte mit 0,5% OsO4 und Inkubation für 30 min.
- Entfernen Glasdeckgläschen enthält Zellen, die aus 24-well Platten und legte den Kopf auf einen Tropfen Wasser. Wash wie dieses 3-mal für 5 min.
- Transfer Deckgläschen wieder in 24-well Zellkulturplatte mit 1% Gerbsäure und Inkubation für 30 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 4,2 bis 4,4
- Entwässern durch die folgende Therapie (5min pro Stück):
- 30% Ethanol
- 50% Ethanol
- 70% Ethanol
- 80% Ethanol
- 90% Ethanol
- 100% Ethanol
- 100% Ethanol
- 100% Ethanol
- Transfer Deckgläser in kritischen Punkt Trockner und trockenen Proben.
- Coat Oberfläche der Probe mit 5 nm Platin / Kohlenstoff-Schicht mit Dünnschichtverdampfer
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die Isolierung Methode ergibt in der Regel nicht stimulierten lebensfähig Neutrophilen mit einer Reinheit von mehr als 95%. Wenn zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation fixiert, zeigt die Immunfärbung Protokoll die Reihenfolge der morphologischen Veränderungen während NETosis Zelle Abflachung, Verlust der nuklearen Läppchen, Verlust von Granulat und Kern Integrität, die eine zunehmende Überschneidung der Kernenergie (dh Histon) und körnig (dh führt Neutrophile Elastase) Färbung. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt, um die spezifischen Interaktionen von Pathogenen mit neutrophilen Granulozyten zu analysieren dienen. Diese Wechselwirkung kann in größerem Detail mit der Vorbereitung Protokoll für Scanning Electron Microscopy seziert werden.
NET Fluorescence
Beispiel der stimulierten Neutrophilen für NET-Komponenten (blau = DNA, rot = Histon, grün = Neutrophile Elastase) gefärbt. Die Bilder zeigen neben den NET-Lokalisierung, die nukleäre Lokalisation von DNA und Histonen und das körnige Muster für Neutrophile Elastase.
SEM PMA-Stimulation
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme zeigt nicht stimuliert und PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten. Nach Stimulation, glätten die Neutrophilen aus und produzieren NETs.
SEM NETs und Shigella
Höhere Auflösung REM-Aufnahme von Shigella Bakterien in NETs gefangen.
Discussion
Die zur Verfügung gestellten Protokoll ermöglicht die Trennung von nicht stimulierten Neutrophilen auf erhebliche Reinheit, die Induktion von NET Bildung und die Analyse der morphologischen Veränderungen während NETosis. Beim Umgang mit den Proben mit Sorgfalt, dh rauen Wasch-Bedingungen, die in den Verlust des größten Teils der lose NETs Ergebnis zu vermeiden, kann die Menge des NET-Bildung unter verschiedenen Bedingungen Stimulation (Dauer, Stimulus) verglichen werden. Neutrophilen / Pathogen-Interaktionen, Folge von Reizen, Zusammenspiel mit anderen Immunzellen: In dieser Hinsicht kann das mitgelieferte Protokolle als Ausgangspunkt, um Methoden zu etablieren, um anspruchsvollere Szenarien analysieren dienen.
References
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