Summary
Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.
Abstract
Periferik kan lökosit nötrofil granülositler en bol bulunan bir grup. Profesyonel fagositler olarak, yutma bakteri ve hücre onları öldürmek phagosome ile antimikrobiyal granül sigorta. Biz nötrofil mikroorganizmaları öldüren ek bir yolu olduğunu bulundu: Etkinleştirme üzerine, birlikte ekstrasellüler lifler oluştururlar granül proteinleri ve kromatin serbest bağlama patojenler. Bu yeni yapılar, veya nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), virülans faktörleri aşağılamak ve bakteri 1, 2 ve parazitler 3 mantar öldürmek. NET'ler yapısal omurga DNA ve DNases varlığı hızla bozulmuş. Böylece, DNases ifade bakteri 4 daha öldürücü. TEM, SEM, immünofloresan ve canlı hücre görüntüleme teknikleri birleştirerek bağıntılı mikroskopi kullanılarak stimülasyon üzerine, nötrofil çekirdekleri şekillerini kaybeder ve ab-ve heterokromatin homojenize gösterebilirim. Daha sonra, nükleer zarf ve granül membranlar NET bileşenleri karıştırma izin parçalanır. Son olarak, NET'ler hücre zarı kesmeleri olarak yayımlanır. Bu hücre ölüm programı (NETosis) apoptoz ve nekroz farklıdır ve NADPH oksidaz 5 Reaktif Oksijen Türleri nesil bağlıdır.
Nötrofil ekstrasellüler tuzakları akut inflamasyon bölgelerinde bol miktarda bulunmaktadır. NET'ler bağlama mikroorganizmaların ki, yayılmasını önlemek ve virülans faktörleri düşürebilir ve böylece nötrofil hatta ömrü ötesinde antimikrobiyal fonksiyonu yerine getirmek için izin patojenleri öldürmek için yüksek antimikrobiyal ajanların yerel yoğunlaşmasını sağlamak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir formu olarak görünür. Kanıtlar artmaktadır, ancak bu NET'ler olan hastalıklar da katılıyor oto-immün sendromlar kısırlık 6 aralığı.
Biz, insan periferik kan 7 ila nötrofil Granülositler izole ve NET'ler oluşturmak için onları teşvik etmek için yöntemleri açıklanmaktadır . Ayrıca ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için protokolleri içerir.
Protocol
1. Insan kanı PMN İzolasyon
Antikoagülan olarak EDTA veya heparin (10 U / ml) ile 24 ml insan kanı hakkında kullanın.
- 6 ml, 15 ml Falcon tüp Histopaque 1119 ekleyin ve dikkatle üst katmanı 5 ila 7 ml tam kan.
- Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg'de santrifüjleyin.
- Sarımsı ve açık üst katman aspire edin ve atın ve taze Falcon tüpler içine granülositler içeren alt kırmızımsı faz transfer.
- 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın
- Bu arada% 100 Percoll, 2 ml 10x PBS, 18 ml Percoll karıştırılarak bir solüsyon hazırlanır. 1x PBS,% 85,% 80,% 75,% 70 ve% Percoll 65 4 ml çözümler hazırlıyoruz.
- Katmanlama 2 ml azalan birbirlerinin üstüne her yüzde bir Percoll degrade ile 2 Falcon tüpleri hazırlayın.
- Santrifüj süpernatantı kaldırdıktan sonra, 4 ml PBS pelet ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri birleştirir.
- Her degradelerin üzerine tabanda dikkatli katman 2 ml.
- Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg'de santrifüjleyin.
- Santrifüj üst katmanı kaldırmak ve% 65 katmanlı en PBMC'ler ile,% 85 katmanlı kadar yeni Falcon tüpler içine beyaz kalan interphases toplamak sonra.
- 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj ile Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın
- PBS 2ml supernatant ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri (genellikle>% 95 PMN.) Çıkarın.
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
2. Aktive PMN
- Steril bir 13 mm yuvarlak cam kapak kayma (1,5) her bir kuyunun içine koyarak 24-iyi bir hücre kültürü tabak hazırlayın
- Tohum 2 x 10 500μl RPMI 5 hücreleri de başına (% 2 insan serum albümin içeren) ve 37 CO 2 inkübatör 1s inkübe ° C.
- Bu arada RPMI 600 nM PMA çözüm hazırlamak ve 100μl de ortalama hücreleri ekleyin. CO 2 inkübatör 4 saat 15 dakika inkübe 37 ° ° C.
- % 4 (son konsantrasyon) PBS içinde çözünmüş paraformaldehid hücreleri saptamak.
PMA bir pozitif kontrol olarak hizmet veren ve bugüne kadar NET oluşumunu uyarmak için en güçlü bir ajandır. Alternatif olarak, patojenlerin diğer uyaranlara veya co-ekimi NET indüksiyonu için kullanılabilir.
Zaman kursu devam ederken ek paralel olarak hazırladığı numuneler NET oluşumu ilgili durumu kontrol edilebilir. Sabit olmayan hücrelere Sytox Yeşil (Invitrogen) gibi olmayan bir permeant DNA boya eklenirse, sadece ekstraselüler DNA tespit edilecektir. Yeni NET'ler oluşumu şekilde her zaman noktası için, Sytox varlığı bozulmuş olduğundan bir paralel örnek kullanılmalıdır.
3. NET immunolabeling tarafından tespit
NET'ler fiksasyon sonra bile çok kırılgan olduğu ve büyük bir dikkatle manipüle edilebilir aksi takdirde çoğunluğu hazırlanması sırasında kaybolan alacak.
- 24 kuyu kültür plaka takılı hücreleri ile cam kapak fişleri kavisli bir iğne ile kenarında yukarı kaldırarak dikkatlice çıkarın ve ince bir forseps ile ele geçirmek. PBS bir damla ters kapak kayma koyun. Bu bir test tüpü standı kapsayan bir Parafilm kağıda yapılabilir. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın.
- Triton X-100 RT az 1 dakika hücreleri permeabilize için% 0.5 'lik bir düşüş aynı şekilde kapak fişleri inkübe edin. 1 dakika için 3 kez PBS içinde yıkayın.
- Parafilm ve ıslak mendil ile nemli bir oda hazırlayın. Lay kapağı engelleme tampon (% 5 eşek serum) bir damla baş aşağı kayar ve 37 ° 30 dakika inkübe ° C.
- Tampon engelleme primer antikorlar, örneğin ms anti Histon ve rb anti nötrofil elastaz, sulandırınız.
- Primer antikor bir damla üzerine tampon engelleme doğrudan nemli odasında fişleri kapağı ve 37 az 1 saat süreyle inkübe transfer ° C
- PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız.
- Ikincil antikorlar, örneğin dk anti ms Cy2 ve tampon engelleme dk anti-rb Cy3 sulandırınız.
- Sekonder antikoru bir damla üzerine nemli odasına fişleri kapağı ve 1 saat boyunca inkübe 37 aktarma ° C.
- PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. Leke DNA UV eksitasyon veya Draq5 kadar kırmızı uyarma için ihtiyaç ve dist ile iki kez yıkamak Hoechst 33.342 (1 mcg / ml) ile 5 dakika ya, floresan mikroskopi seçenekleri bağlı. su.
- Bir cam slayt üzerine Mowiol 20μl damla ayarlayın ve hücreleri ile kapak fişleri ters monte. Hücreleri kapak kayma ve slayt arasında olmak zorunda. Mowiol, açılan kapağı açılan kayma yerleştirilmiş homojen kalınlıkta ince bir tabaka oluşturacak. Normalde, örnek basın gerek yoktur. Olmayan daldırma lens kullanmak istiyorsanız, numunenin incelenmesi için hazır.Daldırma lensler ile mikroskobik inceleme için, Mowiol örnek kenarında katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat için örnek kuru sağlar.
4. Hazırlanması NET'ler Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM)
- Hücreleri,% 2,5 glutaraldehid ile 24 plaka cam kapak bordroları düzeltmek Mesaj.
- 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın.
- 30 dakika süreyle% 0,5 OsO4 ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın.
- 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın.
- 30 dakika süreyle% 1 tannik asit ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın.
- Adımları tekrarlayın 4,2-4,4
- Aşağıdaki rejimi (5 dk her) aracılığıyla dehydrate:
- % 30 etanol
- % 50 etanol
- % 70 etanol
- % 80 etanol
- % 90 etanol
- % 100 etanol
- % 100 etanol
- % 100 etanol
- Kritik nokta kurutma makinesi ve kuru örnekler sığar kapağı aktarın.
- Coat yüzey ince bir tabaka evaporatör kullanılarak 5nm platin / karbon tabaka ile örnek
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Izolasyon yöntem genellikle,% 95 daha yüksek bir saflığa sahip unstimulated yaşayabilir nötrofil verir. Stimülasyon sonrasında farklı zaman noktalarında sabit, NETosis düzleşme hücre, nükleer lobülleri kaybı, granül kaybı ve nükleer (yani histon) ve granül (yani artan bir örtüşme yol açar çekirdeği bütünlüğünü sırasında morfolojik değişiklikler immün protokol sırasını gösterir nötrofil elastaz) boyama. Bu protokol, nötrofil ile patojenlerin özel etkileşimlerini analiz etmek için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir. Bu etkileşim, Taramalı Elektron Mikroskobu için hazırlık protokolü kullanılarak daha ayrıntılı olarak disseke edilebilir.
NET Floresans
NET bileşenleri (mavi = DNA, kırmızı = histon, yeşil = nötrofil elastaz) lekeli uyarılan nötrofillerin örnek. NET lokalizasyonu, nükleer DNA ve histon yerelleştirme ve nötrofil elastaz için granül desen görüntüleri yanı sıra, göstermektedir.
SEM PMA stimülasyon
Olmayan uyarılır ve PMA-uyarılan nötrofillerin gösteren tarama elektron mikrografı. Stimülasyon sonra, nötrofil düzleştirmek ve NET'ler üretmek.
SEM NET'ler ve Shigella
NET'ler sıkışıp Shigella bakterileri Yüksek çözünürlüklü SEM görüntü.
Discussion
Sağlanan protokolü önemli saflık olmayan uyarılan nötrofillerin izolasyon, indüksiyon NET oluşumu ve NETosis sırasında morfolojik değişiklikleri analiz sağlayacaktır. Itina ile örneklerin tutarken, yani en gevşek bağlı NET'ler kaybına neden olacak ağır yıkama koşullarına kaçınarak, farklı stimülasyon koşullar altında NET formasyonu (süresi, uyaran) miktarı mukayese edilebilir. Nötrofil / patojen etkileşimleri, uyaranlara dizisi, diğer bağışıklık hücreleri ile etkileşim: Bu bağlamda, verilen protokoller daha sofistike senaryolar analiz yöntemleri kurmak için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir.
References
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
