Summary
Мы представляем принципы кислорода измерения фосфоресценции закалки и анализа проекта порфирина основе дендритных наносенсоров для кислорода изображений в биологических системах.
Abstract
Кислород измерение фосфоресценции закалки [1, 2] состоит из следующих этапов: 1) датчик поставляется в среду интерес (например, крови или тканевой жидкости), 2) объект освещается светом соответствующей длины волны для возбуждения Расследование его триплетного состояния, 3) испускается фосфоресценции собирается, и его время курса анализируется для выхода фосфоресценции жизни, которая превращается в концентрации кислорода (или парциальное давление, PO
Protocol
1. Общая характеристика кислорода протокол измерений
(Этот раздел не имеет каких-либо действий, но имеет решающее значение для понимания остальной части газеты. Это может быть снят, например, как последовательность нескольких слайдов в формате Power Point, сопровождаемый голосом.)
1.1) зонд поставляется в среде интерес, например, вводят в крови или тканевой жидкости животного.
1.2) объекта (поверхности ткани) освещается светом соответствующей длины волны в целях содействия расследованию его возбужденное триплетное состояние. Обычно возбуждение происходит через один-фотонного механизма. Однако, в случае особой двухфотонного повышенной зонды, возбуждение может быть сделано с помощью двухфотонного механизма, который позволяет использовать зонды в высоком разрешении применения микроскопии. Один-фотонного возбуждения как правило, дает меньше пространственного разрешения, но требует простой аппаратуры и может быть использован в одной точке измерения со светодиодной основе волоконно-оптических phosphorometers.
1.3) фосфоресценции, испускаемого зонда происходит от долгоживущих триплетном состоянии. Зонд молекула должна быть специально разработана, чтобы дать высокий квантовый выход триплетного состояния и испускают свечение вместо флуоресценции. Хотя в триплетном состоянии, зонд может испытывать столкновительной столкновений с молекулами кислорода, который может деактивировать триплетное состояние - ". Закалки" процесс, называемый В отсутствие кислорода, время жизни триплетного состояния, а следовательно, фосфоресценция распада, τ 0. В присутствии кислорода, фосфоресценция жизни (τ) сокращается в результате закалки. Существует прямая зависимость между временем жизни триплетного состояния и количества кислорода в окружающей среде. Это известный Штерна-Фольмера отношений, которая связывает время жизни (τ) фосфоресценции к концентрации кислорода [O 2] (или парциальное давление кислорода рО 2):
В биологических системах, кислород на сегодняшний день является наиболее эффективным утоления фосфоресценции, что делает метод тушения фосфоресценции очень избирательно к кислороду.
1.4) Для того чтобы измерить время жизни т, испускаемые фотоны фосфоресцирующих binned во времени. Например, после импульса возбуждения, 200 фотоны могут быть собраны в первые 15 микросекунд, 150 фотонов, собранных в течение 15 микросекунд, и так далее, пока не фотоны собираются. Номера в закромах заговор против времени дают фосфоресценции распада, которая анализируется для получения жизни τ. В изображений, эта процедура применяется в каждом пикселе изображения, в результате чего фосфоресценция карт жизни. Измерения жизни не чувствительны к неоднородности распределения зонда по всему объекту, который является общим для биологических образцов. Таким образом, отчет жизни только на кислород. Время жизни τ преобразуются в концентрации кислорода использованием Штерна-Фольмера отношения.
2. Строительство фосфоресцирующих зондов
Фосфоресцирующая зонды для измерения кислорода в биологических системах состоят из фосфоресцирующих пигментов (ядер), инкапсулированных в клетки построены дендримеров - высоко регулярные сверхразветвленных полимеров [3]. Дендримеров защиты ядра от взаимодействия с окружающей средой и управления скоростью диффузии кислорода к ядер, что позволяет оптимизировать чувствительность и динамический диапазон зондов (постоянная к д в Штерна-Фольмера отношения). Концы дендримеров были изменены с химически инертных гидрофильных полиэтиленгликоля (ПЭГ) групп, что делает зондов высоко растворимые в воде и предотвращения их взаимодействия с биологическими макромолекулами.
Фосфоресцирующая сердечников датчиков Pt или Pd комплексов порфиринов и π-расширенных порфиринов. π-Extended порфиринов порфиринов, в котором пиррольных колец слиты с внешними фрагменты ароматный. π-Extension позволяет настройку зондов спектроскопических свойств для удовлетворения требований конкретного приложения визуализации (например, микроскопия против томографии). В качестве примера, мы описываем синтез tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PdAr 4 ТБФ) [4]. PdAr 4 ТБФ в имеют мощные полосы поглощения в дальней красной части спектра фосфоресценции и сильные, хорошо подходит для биологических измерений кислорода.
Синтез PdAr 4 ТБФ состоит из следующих шагов:
2.1) Подготовка tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) Линдси конденсации [5] tetrahydroisoindole с замещенными бензальдегидов. Чтобы 0,01 М раствора tetrahydroisoindole (1 экв) в СН <SUB> 2 CL 2 ароматических альдегидов (1 экв) был добавлен в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре BF 3 Xet 2 O (0,2 экв) был добавлен, и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение еще 2 ч. DDQ (1 экв) был добавлен, и смесь оставляют на ночь при непрерывном перемешивании. Раствор промывали 10% водным Na 2 SO 3, 10% водный Na 2 CO 3, 5% водный HCl и, наконец, с рассолом. Органическую фазу сушат над Na 2 SO 4, затем концентрируют в вакууме. Остаток перекристаллизовывают из CH 2 Cl 2 - трет-бутиловый эфир смеси, чтобы дать Ar 4 TCHP как зеленый порошок. Урожайность около 50%.
2.2) Введение Pd получить PdAr 4 TCHPs. Бесплатная база порфиринов (1 экв) лечили PdCl 2 или Pd (OAc) 2 (1,2 экв) в кипящем CH 3 CN в присутствии избытка Et 3 N (20 экв). Преобразование контролировали с помощью УФ-спектроскопии отношению (растворитель CH 2 Cl 2-уксусной кислоты) и считается завершенным после Соре полосу диктант на 468-472 нм исчезли. Смесь остынет, разбавляют CH 2 Cl 2 и фильтруют через тонкий слой целит для удаления Pd (0). Растворитель выпаривали, а остаток очищали с помощью хроматографии на колонке с силикагелем использованием CH 2 Cl 2 в качестве растворителя. Темно-красный фракцию собирали, растворитель выпаривают, получая целевой PdAr 4 TCHPs почти количественным выходом.
2.3) PdAr 4 ТВР были подготовлены при окислении PdAr 4 TCHPs с 2-кратным превышением DDQ (16 экв) в ТГФ кипятят. Во время кипячения, цвет изменяется от темно-красного до темно-зеленые. Растворитель выпаривали, остаток разбавляли CH 2 Cl 2, промывали 10% водным Na 2 SO 3, водой и рассолом. Органическую фазу сушат над Na 2 SO 4 и концентрируется в вакууме. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (элюент CH 2 Cl 2). Первая темно-зеленые фракция была собрана, сконцентрирована в вакууме, получая 85-90%, как сине-зеленый порошок PdAr4TBP в.
2,4) периферийных групп эфир Pd тетракис-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) гидролизуются с помощью 10-кратного избытка КОН в 1% (об. / об) вода / ТГФ при комнатной температуре. Растворитель сливают с осадка образуются калийных солей карбоновых кислот из PdAr4TBP в. Твердое вещество растворяется в воде, перемешивают в течение еще 2 ч, подкисляют конц. HCl до рН ~ 4-5. Получен осадок отделяют центрифугированием, промывают водой и сушат в вакууме.
Защита дендрона. Каждая отдельная ветвь дендримеров называется дендрона. Защита дендрона построены из арил-глицина (АГ), строительных блоков. А. Г. дендрона могут быть легко синтезированы из недорогих исходных материалов и изолированы в высокой степени чистоты и выхода с помощью хроматографии без методов. Синтез поколения 2 (G2) AG-дендрона состоит из следующих шагов:
2,4) Синтез строительных блоков, Бок защищенный 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide и 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, использование Фишер haloacyl галоидных метод.
2.5) Взаимодействие строительных блоков использованием CDMT / НММ химии связи пептида.
2,6) снятия защиты координационного аминогруппы путем перемешивания решение G2 дендрона в TFA в течение 2 ч при комнатной температуре
2,7) Для сборки выше дендрона поколения, сцепление / снятия защиты шаги повторяются.
Дендримера сборки достигается за счет связи снимают защиту дендрона к PdAr4TBP (или другой порфирина), используя HBTU / DIPEA связи химии.
2.8) Во-первых, Вос-защитные группы удаляют из дендрона. Например, Бок защищенных G3 дендрона (0,58 г) растворяли в TFA (15 мл) и смесь оставляют реагировать при комнатной температуре 2 часа. Кислоту удаляли на роторном испарителе, уступая дендрона как TFA-солью. Остаток растворяли в сухом NMP (10 мл) и несколько капель DIPEA были добавлены, чтобы утолить следы TFA.
2.9) Перед началом реакции сочетания, очень важно, до полного растворения порфиринов. Например, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 г) растворяют в сухом NMP (65 мл) при нагревании при 140 ° С в течение 10 мин, в токе азота.
2,10) раствор охлаждают до комнатной температуры, HBTU (0,211 г) добавляли, и смесь перемешивают в течение 5 мин.
2,11) DIPEA (0,35 мл) добавляют к смеси в одной порции, сразу же с последующим добавлением solutiна ТФК-соль дендрона в NMP (см. п. 2.8), и смесь оставляют на ночь при перемешивании.
2,12) смесь выливали в 3% водн. NaCl (350 мл), и в результате осадок собирали центрифугированием и промывают водой, метанолом и Et 2 O повторяющимися подвеска / центрифугирования для получения целевого порфирина-дендримеров.
2,13) для гидролиза периферийные группы эфир, дендримеров был впервые рассмотрен с NMe 4 OH (~ 5 мМ) в ДМСО / MeOH за период 20-60 мин, а затем полное удаление растворителя. Эта процедура позволила нам создать дендримеров с достаточным количеством карбоксильные группы, чтобы дать растворимостью в воде. Для завершения гидролиза, дендримеров обрабатывают 0,1 н водный NaOH (на ночь). В результате, чистые порфирина-дендримеров карбоновые кислоты могут быть выделены в 80-95% урожая.
Модификация периферии дендример. На данный момент, начиная с той же порфирина-дендримеров, либо одно-или двух-фотонного зонды могут быть синтезированы. В первом случае все периферические карбоксильные группы модифицированные ПЭГ единиц - методологии, известной как PEGylation. В последнем случае, несколько карбоксильных групп в сочетании с первым двухфотонного антенны хромофоров (Кумарин-343), модифицированные этилендиамин (EDA) линкеров, а затем PEGylation оставшихся карбоксилы [6]. Дендримеров были пегилированный использованием monomethoxyoligoethyleneglycolamine (м-ПЭГ-NH 2, Av. MW 1000) с использованием HBTU / DIPEA связи химии.
2.14) Для решения дендрона в NMP (или DMF) (1-10 мм), 1,25-кратное превышение HBTU был добавлен, и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. 6,25-кратное превышение DIPEA был добавлен, после чего немедленно добавлением 1,25-кратное превышение м-ПЭГ-NH2. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 дней при комнатной температуре. Диэтиловый эфир был добавлен в реакционной смеси образуется осадок отделяли центрифугированием и повторно осаждают из ТГФ добавлением диэтилового эфира.
2,15) Заключительная очистка была достигнута с гель-хроматографии на сбор первой фазе фронт. Пегилированный порфирина-дендримеров растворяется в небольшом количестве ТГФ (~ 15 мл) и загружаются на верхней части хроматографической колонки заполнены полистиролом SEC фазы (Biorad, Biobeads S-X1). Колонку элюировали с чистой ТГФ, и темная полоса, движущихся с передней была собрана.
2,16) ТГФ удаляли на роторном испарителе, а оставшийся материал высушивали в вакууме.
3. Зонд характеристика
Фотофизические характеристика включает измерения поглощения и испускания зонда спектров фосфоресценции жизни τ 0 и Штерна-Фольмера кислорода константы тушения к д в физиологических условиях.
3.1) спектры поглощения и излучения получены в условиях окружающей среды с использованием стандартных измерительных приборов (спектрофотометра и устойчивый флуорометр). ~ 1 мкм решения зонд используется.
3.2) Далее, Штерна-Фольмера калибровочный график получается. Это наиболее важный показатель, поскольку он позволяет нам связать жизни зонд для концентрации кислорода.
3.3) решения зонда в PBS буфере (рН 7,2) помещается в специальную цилиндрическую кювету, которая находится внутри камеры с контролируемой температурой, расположенной внутри световых непроницаемой клетке с портами для возбуждения и испускания оптических волокон. Волокна были приведены в тесном контакте с кювета внутри камеры в правом углу геометрии.
3.4) кюветы закрывают пробкой, в которую очень чувствительны Кларк типа кислородного электрода (CK-кислородного электрода) вставляется. Пробкой также содержит два порта иглы для входа и выхода аргона. Электрод погружен в раствор, в то время как иглы просто обеспечить поток газа над раствором поверхность. Сначала, аргон не подключен к входу.
3,5) температура установлена в нужное значение (обычно 36-37 ° С) и раствор оставляют при перемешивании в течение уравновешивания.
3,6) возбуждения волокна связана с возбуждением порт цифрового phosphorometer, управляемый ПК. Источником света в phosphorometer является мощным светодиодом, выход которого находится под контролем 333 кГц D / платы. Выбросов волокно подключен к другому оптический порт phosphorometer, который связан с высокой инфракрасных чувствительных APD (лавинный фотодиод). Вывод диода усиливается и подается на аналого-цифровой канал этого же пульт управления, который позволяет синхронизировать между возбуждения и эмиссии каналов.
3.7) программного обеспечения управления др.минимумов поколения импульсов возбуждения любой нужной длины (например, 5 или 10 мс), после чего коллекция фосфоресценции при распаде произвольного выбранного периода (обычно 2-3 мс). Время, необходимое для одного измерения жизни, как правило, 0,5-1 с, однако, измерения могут быть получены так быстро, как 10-20 в секунду.
3,8) выход кислорода электродов усиливается и направляется в другую / D доска на одном компьютере. Это низкая плата частоты (1 кГц макс), который используется для записи ток электрода на отдельных периодов времени. Программа для записи данных электрод работает одновременно с phosphorometer программного обеспечения.
3.9) Как только температура раствора находится в равновесии, как phosphorometer и электродом программ инициализируются в то же время для выполнения измерений каждые 10 секунд Их выходы регистрируются синхронно на две отдельные файлы. После этого, аргон подключен к входному порту на пробку кюветы.
3.10) Как аргона течет по поверхности раствору, он постепенно заменяет кислород. Это приводит к снижению электрода тока и увеличение фосфоресценции жизни, которое измеряется phosphorometer. Как правило, кислород вытесняется формой решение полностью примерно через 2 часа, в течение которых данные полностью автоматический вход в файлы.
3.11) После окончания титрования перспективе электрода данных и фосфоресценции жизни импортируются в стандартную программу анализа (например, Miocrocal происхождения). Электрода ток линейно зависит от концентрации кислорода, а для электрода использовали его практически равна нулю при нулевом кислорода. При атмосферном давлении, рО 2, как известно (около 150 мм рт.ст.). Таким образом, электрод данные могут быть непосредственно преобразуется в кислород масштаба, и сюжет обратной фосфоресценции жизни по сравнению с рО 2 может быть построена. Этот участок оснащен прямой линии с помощью метода наименьших квадратов, чтобы дать кислород тушение постоянной кд как ее наклон. Фосфоресценции жизни t0 получается либо из того же подходят (как обратный перехват) или непосредственно из измерений на нулевой кислорода.
3.12) При необходимости титрования повторяют с использованием решения зонда в присутствии альбумина - белка присутствуют в плазме крови в высоких концентрациях, - для того, чтобы эмулировать условия встретились в реальной экспериментальной системы (кровь животных в естественных условиях). Получить Штерна-Фольмера участки должны быть одинаковыми, если дендримеров защищает датчик хорошо и PEG групп изолировать датчик от контактов с альбумином. В противном случае датчик и белков в крови будут взаимодействовать, и это приведет к изменена Штерна-Фольмера участок, вызывая неоднозначность в кислороде измерений.
Полученная таким образом константы калибровки используются в экспериментах, где изображения концентрации кислорода являются неизвестными априори.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Поддержка гранты EB007279 и HL081273 от НИЗ США с благодарностью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
- Lebedev, A. Y. Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems. Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).
- Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins. Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).
- Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions. Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).
- Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen. J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).
