Summary
Apresentamos os princípios de medições de oxigênio por quenching fosforescência e da revisão do projeto porfirina baseado nanosensores dendríticas para geração de imagens de oxigênio em sistemas biológicos.
Abstract
Medição de oxigênio por quenching fosforescência [1, 2] consiste das seguintes etapas: 1) a sonda seja entregue para o meio de interesse (por exemplo, sangue ou líquido intersticial), 2) o objeto é iluminado com luz de comprimento de onda adequado a fim de excitar a sonda em seu estado triplet, 3) a fosforescência emitido é coletado, e respectiva evolução no tempo é analisado para produzir o tempo de vida de fosforescência, que é convertido para a concentração de oxigênio (ou pressão parcial, pO
Protocol
1. Descrição geral do protocolo de medição de oxigênio
(Esta seção não tem nenhuma ação, mas é crucial para compreender o resto do papel. Pode ser filmado, por exemplo, como uma seqüência de slides um Ponto de alguns Power, acompanhada pela voz.)
1.1) A sonda é entregue para o meio de interesse, por exemplo, injetado no sangue ou líquido intersticial de um animal.
1.2) O objeto (superfície do tecido) é iluminado com a luz de comprimento de onda adequado a fim de promover a investigação sobre seu estado triplet animado. Tipicamente excitação ocorre através do mecanismo de um fóton. No entanto, no caso do especial de dois fótons avançada sondas, excitação pode ser feito através do mecanismo de dois fótons, que permite usar as sondas em aplicações de alta resolução da microscopia. Um fóton-excitação geralmente fornece uma resolução espacial menor, mais simples, mas requer instrumentação e pode ser usado em um único ponto medições com LED baseado em fibra óptica phosphorometers.
1,3 fosforescência) emitidos pela sonda se origina do estado triplete de vida longa. A molécula sonda deve ser especialmente concebido para dar rendimento quântico elevado do estado triplete e emitem fosforescência, em vez de fluorescência. Enquanto que no estado triplete, a sonda pode experimentar encontros colisão com as moléculas de oxigênio, que pode desactivar o estado triplete - ". Quenching" de um processo chamado Na ausência de oxigênio, a vida do estado triplete, e, portanto, a decadência fosforescência, é τ 0. Na presença de oxigênio, a vida de fosforescência (τ) é reduzido como resultado da extinção. Existe uma relação direta entre o tempo de vida do estado triplete e da quantidade de oxigênio no ambiente. Esta é a bem conhecida relação de Stern-Volmer, que liga a vida (τ) da fosforescência à concentração de oxigênio [O 2] (ou pressão parcial de oxigênio pO 2):
Em sistemas biológicos, o oxigênio é de longe o mais eficaz quencher de fosforescência, o que torna o método de têmpera fosforescência muito seletivos ao oxigênio.
1.4) A fim de medir o tempo de vida t, os fótons emitidos fosforescente são binned no tempo. Por exemplo, após o pulso de excitação, 200 fótons podem ser coletadas nos primeiros 15 microssegundos, 150 fótons coletados nos próximos 15 microssegundos, e assim por diante, até que não os fótons são coletados. Os números nas caixas plotados contra o tempo dar o decaimento de fosforescência, que é analisado para produzir o tempo de vida τ. Na imagem, este procedimento é aplicado em cada pixel da imagem, resultando em mapas vida fosforescência. Medições de vidas são insensíveis ao heterogeneidades de distribuição sonda ao longo do objeto, que é comum para amostras biológicas. Assim, vidas relatório apenas em oxigênio. Vidas τ são convertidos em concentrações de oxigênio utilizando a relação de Stern-Volmer.
2. Construção de sondas fosforescente
Sondas fosforescente para medições de oxigênio em sistemas biológicos consistem de cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulados em gaiolas construídas de dendrímeros - altamente regular polímeros hiper [3]. Dendrímeros proteger os núcleos a partir de interações com o meio ambiente e controle da taxa de difusão de oxigênio para os núcleos, tornando possível para otimizar a sensibilidade ea faixa dinâmica das sondas (constante k q na relação Stern-Volmer). Términos do dendrímeros são modificados com polietileno glicol quimicamente inerte hidrofílico (PEG) grupos, fazendo com que as sondas altamente solúvel em água e impedindo a sua interação com macromoléculas biológicas.
Núcleos fosforescente das sondas estão Pt ou Pd complexos de porfirinas e porfirinas π-extended. π-Extended porfirinas são porfirinas em que anéis de pirrol são fundidos com fragmentos aromáticos externo. Extensão-π permite o ajuste das propriedades sondas espectroscópicas para satisfazer as exigências de uma aplicação de imagem em particular (por exemplo, a tomografia de microscopia vs). Como exemplo, descrevemos a síntese de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP têm bandas de absorção poderosa na parte extrema-vermelha do espectro de fosforescência e forte, adequado para medições de oxigênio biológico.
A síntese de quatro PdAr TBP consiste das seguintes etapas:
2.1 Preparação) de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensação [5] de tetrahydroisoindole com benzaldeídos substituídos. Para uma solução M de 0,01 tetrahydroisoindole (1 eq) em CH <sub> 2 CL 2 do aldeído aromático (1 eq) foi adicionado sob argônio. A mistura de reação foi agitada por 10 min no escuro a RT BF 3 XlT 2 O (0,2 eq) foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por mais 2 h. DDQ (1 eq) foi adicionado, ea mistura foi deixada durante a noite, sob agitação contínua. A solução foi lavada com 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq e finalmente com salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4, então concentrada no vácuo. O resíduo foi recristalizado de CH 2 Cl 2 - terc-butil éter mistura para dar Ar 4 TCHP como pó verde. Rendimentos são cerca de 50%.
2,2) Inserção de Pd para obter PdAr 4 TCHPs. Livre-base porfirinas (1 eq) foram tratados com PdCl 2 ou Pd (OAc) 2 (1,2 eq) em CH 3 CN refluxo na presença de excesso de Et 3 N (20 eq). A conversão foi monitorada por espectroscopia UV-vis (CH 2 Cl 2 de solvente-ácido acético) e considerado completo após a banda Soret de ditado em 468-472 nm desapareceu. A mistura foi autorizado a arrefecer, diluída com CH 2 Cl 2 e filtrada através de uma fina camada de Celite para remover Pd (0). O solvente foi evaporado, eo resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fração vermelho escuro foi coletado, o solvente foi evaporado para dar alvo PdAr 4 TCHPs no rendimento de quase quantitativa.
2.3) PdAr 4 TBP foram preparados por oxidação de PdAr 4 TCHPs com o excesso de duas vezes maior de DDQ (16 eq) em THF refluído. Durante refluxo, a cor passou de vermelho-escuro para verde-escuro. O solvente foi evaporado, o resíduo foi diluído com CH 2 Cl 2, lavada com 10% aq Na 2 SO 3, água e salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na 2 SO 4 e concentrada no vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (eluente CH 2 Cl 2). A fração de verde-escuro primeiro foi coletado, concentrado no vácuo para dar 85-90% de pó como o azul-verde do PdAr4TBP.
2.4) grupos éster periférica de Pd-tetrakis (3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) foram hidrolisadas utilizando 10 vezes o excesso de KOH em 1% (v / v) de água / THF no rt. O solvente foi decantado do precipitado de sais de potássio formado de derivados do ácido carboxílico de PdAr4TBP é. Os sólidos foram dissolvidos em água, agitada por mais 2 h, acidificadas com conc. HCl para pH ~ 4-5. O precipitado obtido foi isolado por centrifugação, lavado com água e secas em vácuo.
Proteger dendrons. Cada ramo individual do dendrímero é chamado dendron. Dendrons proteção são construídas de aril-glicina blocos (AG) de construção. Dendrons AG pode ser facilmente sintetizado a partir de matérias-primas baratas e isolados em alta pureza e rendimento por cromatografia em fase livre de métodos. Síntese de geração 2 (G2) AG dendron consiste das seguintes etapas:
Síntese 2,4) dos blocos de construção, Boc-protegidos 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizando do método haloacyl Fischer haleto.
2.5) Acoplamento dos blocos de construção usando CDMT / química acoplamento NMM peptídeo.
2.6) desprotegerem o grupo focal amino agitando a solução do dendron G2 em TFA por 2 h à temperatura
2.7) Para a montagem do dendrons maior geração, acoplamento / desproteção etapas são repetidas.
Dendrímero montagem é conseguida pelo acoplamento do dendrons deprotected para PdAr4TBP (ou porfirina outros) usando a química acoplamento HBTU / DIPEA.
2.8) Em primeiro lugar, os grupos Boc-protetores são removidos do dendron. Por exemplo, Boc-protegidos dendron G3 (0,58 g) foi dissolvida em TFA (15 ml), ea mistura foi deixada para reagir à temperatura ambiente por 2h. O ácido foi removido por evaporação rotativa, produzindo a dendron como o TFA-sal. O resíduo foi dissolvido em NMP seco (10 ml) e algumas gotas de DIPEA foram adicionados, para extinguir os vestígios da TFA.
2.9) Antes de iniciar a reação de acoplamento, é fundamental para dissolver completamente o porfirina. Por exemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) foi dissolvida em NMP seco (65 ml), sob aquecimento a 140 ° C por 10 min, sob fluxo de nitrogênio.
2.10) A solução foi resfriada à temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) foi adicionado, ea mistura foi agitada por 5 min.
2.11) DIPEA (0,35 ml) foi adicionado à mistura em uma parcela, imediatamente seguido por adição do solutina de TFA-sal da dendron em NMP (ver 2.8), ea mistura foi deixada sob agitação durante a noite.
2.12) A mistura foi vertida em aq 3%. NaCl (350 ml), sendo o precipitado resultante foi coletado por centrifugação e lavado com água, MeOH, e 2 Et O por suspensão repetitivos / centrifugação para produzir o alvo porfirina-dendrímero.
2.13) Para hidrolisar os grupos de éster de periféricos, o dendrímero foi tratado com NME 4 OH (~ 5 mM) em DMSO / MeOH mais de 20-60 min período, seguido de a remoção completa do solvente. Este procedimento nos permitiu gerar dendrímeros com número suficiente de grupos carboxilato dar solubilidade em água. Para completar a hidrólise, o dendrímero foi tratada com NaOH 0,1 N aquosa (overnight). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos podem ser isolados em rendimentos de 80-95%.
Modificação da periferia dendrímero. Neste ponto, a partir da mesma porfirina-dendrímero, seja uma ou duas sondas de fótons podem ser sintetizados. No primeiro caso, todos os grupos carboxila periféricos são modificados com unidades PEG - uma metodologia conhecida como PEGylation. Neste último caso, vários grupos carboxila são primeiramente acoplado com cromóforos de dois fótons de antena (cumarina-343) modificados com etilenodiamina (EDA) linkers, seguido por PEGylation do carboxyls restantes [6]. Dendrímeros foram PEGylated usando monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. Prof. MW 1000) usando HBTU / DIPEA química acoplamento.
2.14) A uma solução do dendron em NMP (ou DMF) (1-10 mM) 1,25 vezes o excesso de HBTU foi adicionado, ea mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 10 min. Excesso de 6,25 vezes maior de DIPEA foi adicionado, seguido pela adição imediata de 1,25 vezes o excesso de m-PEG-NH2. A mistura de reação foi agitada por 2 dias a rt. Éter etílico foi adicionado à mistura de reação, o precipitado formado foi separado por centrifugação e re-precipitado de THF pela adição de éter etílico.
2,15) Final de purificação foi alcançado com o tamanho-exclusão por cromatografia a coleta da fase de primeira frente. PEGylated porfirina-dendrímero foi dissolvido em uma pequena quantidade de THF (~ 15 ml) e carregado no topo de uma coluna cromatográfica preenchida com poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). A coluna foi eluída com THF puro, ea banda de cor escura se movendo com a frente foi coletado.
2.16) THF foi removido em um evaporador rotativo, eo material remanescente foi seco em vácuo.
3. Caracterização sonda
Caracterização fotofísicas inclui medições de espectros a sonda de absorção e emissão, fosforescência vidas τ 0 e Stern-Volmer oxigênio quenching constantes k q em condições fisiológicas.
3.1) O espectro de absorção e emissão são obtidos sob condições de ambiente usando a instrumentação padrão (espectrofotômetro e fluorímetro estável). ~ 1 mM soluções da sonda é usada.
3.2) Em seguida, a curva de calibração Stern-Volmer é obtido. Esta é a medida mais importante, porque nos permite relacionar a vida útil da sonda para a concentração de oxigênio.
3.3) A solução da sonda em tampão PBS (pH 7,2) é colocado em uma cubeta cilíndrica especial, que é posicionado dentro da câmara de temperatura controlada, localizado dentro de uma gaiola de luz impermeável com portas para excitação e emissão de fibras ópticas. As fibras são colocados em contato próximo com a cubeta dentro da câmara na geometria de ângulo reto.
3.4) A cuvete é fechado com uma tampa, no qual um eletrodo de oxigênio altamente sensíveis do tipo Clark (CK-eletrodo de oxigênio) é inserido. A rolha também contém duas portas agulha para entrada e saída de argônio. O eletrodo é imerso na solução, enquanto que as agulhas apenas prever o fluxo de fluxo de gás acima da superfície da solução. Na primeira, o argônio não está conectado à entrada.
3.5) A temperatura é definida para o valor desejado (tipicamente 36-37 ° C) ea solução é deixada sob agitação de equilíbrio.
3.6) A fibra de excitação é conectado à porta de excitação de um phosphorometer digital, operada por um PC. A fonte de luz na phosphorometer é um LED de alta potência, cuja produção é controlada por um 333 kHz D / A bordo. A fibra de emissão é ligado a outra porta óptica do phosphorometer, que é acoplado a um APD altamente sensível ao infravermelho (fotodiodo avalanche). A saída do diodo é amplificado e alimentado no canal A / D da placa de controle mesmo, o que permite a sincronização entre a excitação e os canais de emissão.
3.7) O controle de software albaixos geração de pulsos de excitação de qualquer comprimento desejado (por exemplo, 5 ou 10 ms), seguido da coleta de decaimento de fosforescência durante qualquer período arbitrário escolhido (tipicamente 2-3 ms). Tempo necessário para uma medição única vida é tipicamente 0,5-1 s, no entanto, as medições podem ser obtidas tão rapidamente quanto 10-20 por segundo.
3.8) A saída do eletrodo de oxigênio é amplificada e direcionada para outro A / D bordo no mesmo PC. Esta é uma placa de baixa freqüência (1 kHz máx), que é usado para gravar o eletrodo de corrente em períodos de tempo selecionado. O programa para gravar os dados do eletrodo é executado simultaneamente com o software phosphorometer.
3.9) Uma vez que a temperatura da solução é equilibrada, tanto phosphorometer o eletrodo e os programas são inicializados ao mesmo tempo para realizar as medições a cada 10 s. Suas saídas são registradas de forma síncrona em dois arquivos separados. Depois disso, o argônio é conectado à porta de entrada sobre a rolha cuvete.
3.10) Como argônio flui sobre a superfície da solução agitada, gradualmente substitui o oxigênio. Isso resulta em uma diminuição da corrente de eletrodo e um aumento no tempo de vida de fosforescência, que é medido pelo phosphorometer. Normalmente, o oxigênio é deslocado formar a solução totalmente após cerca de 2 h, durante o qual os dados são totalmente desconectado automaticamente em arquivos.
3.11) Após o final da corrida de titulação, os dados do eletrodo e as vidas fosforescência são importados para um programa de análise padrão (Origem Miocrocal por exemplo). A corrente do eletrodo depende linearmente da concentração de oxigênio, e para o eletrodo usado é praticamente zero em oxigênio zero. À pressão atmosférica, pO 2 é conhecido (cerca de 150 mm Hg). Assim, os dados do eletrodo podem ser diretamente convertidos para a escala de oxigênio, eo enredo da vida de fosforescência inversa x pO 2 pode ser construído. Este lote está equipado com uma linha reta pelo método dos mínimos quadrados para dar a têmpera kq de oxigênio constante como sua inclinação. Tempo de vida de fosforescência t0 é obtido a partir do encaixe mesmo (como o inverso do intercepto) ou diretamente a partir da medição em zero oxigênio.
3.12) Se necessário, a titulação é repetido utilizando uma solução da sonda na presença de albumina - uma proteína presente no plasma sanguíneo em altas concentrações, - a fim de imitar as condições reunidas no sistema real experimental (sangue de um animal in vivo). A obtenção de Stern-Volmer parcelas devem ser idênticas, se o dendrímero está protegendo o sensor de medição e grupos PEG isolar a sonda a partir dos contatos com a albumina. Caso contrário, a sonda e as proteínas no sangue irá interagir, e que levará a uma trama Stern-Volmer alteradas, causando ambigüidade nas medições de oxigênio.
Constantes de calibração assim obtidos são usados em experimentos com imagens em que as concentrações de oxigênio são um desconhecido a priori.
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Acknowledgments
Apoio da EB007279 subvenções e HL081273 dos EUA NIH é reconhecido agradecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-methylpyrrolidinone | NMP | ||
| trifluoroacetic acid | TFA | ||
| diisopropylethylamine | DIPEA | ||
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate | HBTU | ||
| dimethylsulfoxide | DMSO | ||
| CDMT=1-chloro-3,5-dimethoxytriazine | CDMT | ||
| NMM=N-methylmorfoline | NMM |
References
- Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence. J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue. Science. 241, 1649-1651 (1988).
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